Altsgeymer kasalligida (AD) uning ko'plab asosiy patofiziologiyasini aks ettiruvchi oqsil biomarkerlari yo'q, bu tashxis va davolashning rivojlanishiga to'sqinlik qiladi. Bu erda biz AD patofiziologiyasining keng doirasini ifodalovchi miya omurilik suyuqligi (CSF) biomarkerlarini aniqlash uchun keng qamrovli proteomikadan foydalanamiz. Multipleks massa spektrometriyasi AD CSF va miyada mos ravishda taxminan 3500 va taxminan 12000 oqsilni aniqladi. Miya proteomasining tarmoq tahlili bioxilma-xillikning 44 ta modulini hal qildi, ulardan 15 tasi miya omurilik suyuqligi proteomasi bilan bir-biriga mos tushdi. Ushbu bir-biriga o'xshash modullardagi CSF AD markerlari turli patofiziologik jarayonlarni ifodalovchi beshta protein guruhiga birlashtirilgan. AD miyasida sinapslar va metabolitlar kamayadi, ammo CSF ortadi, miya va CSFda glialga boy miyelinatsiya va immun guruhlar ortadi. Paneldagi o'zgarishlarning izchilligi va kasallikning o'ziga xosligi 500 dan ortiq qo'shimcha CSF namunalarida tasdiqlangan. Ushbu guruhlar asemptomatik ADda biologik kichik guruhlarni ham aniqladilar. Umuman olganda, bu natijalar ADda klinik ilovalar uchun veb-asoslangan biomarker vositalariga nisbatan istiqbolli qadamdir.
Altsgeymer kasalligi (AD) butun dunyo bo'ylab neyrodegenerativ demansning eng keng tarqalgan sababi bo'lib, sinaptik uzatish, glial vositachilik immuniteti va mitoxondriyal metabolizmni o'z ichiga olgan biologik tizim disfunktsiyalarining keng doirasi bilan tavsiflanadi (1-3). Biroq, uning o'rnatilgan protein biomarkerlari hali ham amiloid va tau oqsillarini aniqlashga qaratilgan va shuning uchun bu turli xil patofiziologiyani aks ettira olmaydi. Miya omurilik suyuqligida (CSF) eng ishonchli o'lchanadigan ushbu "yadro" protein biomarkerlari quyidagilarni o'z ichiga oladi: (i) amiloid beta peptid 1-42 (Ab1-42), bu kortikal amiloid plaklarining shakllanishini aks ettiradi; (ii) total tau, akson degeneratsiyasi belgisi; (iii) fosfo-tau (p-tau), patologik tau giperfosforilatsiyasining vakili (4-7). Ushbu miya omurilik suyuqligi biomarkerlari bizning "belgilangan" AD oqsil kasalliklarini (4-7) aniqlashni sezilarli darajada osonlashtirgan bo'lsa-da, ular kasallikning orqasida joylashgan murakkab biologiyaning kichik bir qismini ifodalaydi.
AD biomarkerlarining patofiziologik xilma-xilligining yo'qligi ko'plab muammolarni keltirib chiqardi, jumladan (i) AD bilan og'rigan bemorlarning biologik heterojenligini aniqlash va miqdorini aniqlashning iloji yo'qligi, (ii) kasallikning og'irligi va rivojlanishini, ayniqsa, klinikadan oldingi bosqichda, va ( iii) nevrologik buzilishning barcha jihatlarini to'liq hal qila olmagan terapevtik preparatlarni ishlab chiqish. Tegishli kasalliklardan ADni tavsiflash uchun muhim patologiyaga tayanishimiz bu muammolarni yanada kuchaytiradi. Ko'proq va ko'proq dalillar shuni ko'rsatadiki, demansli keksa odamlarning ko'pchiligi kognitiv pasayishning bir nechta patologik xususiyatlariga ega (8). AD patologiyasi bo'lgan odamlarning 90% yoki undan ko'prog'ida qon tomir kasalliklari, TDP-43 inklyuziyalari yoki boshqa degenerativ kasalliklar mavjud (9). Patologik o'zaro bog'liqlikning yuqori nisbati bizning demans uchun hozirgi diagnostika asosimizni buzdi va kasallikning yanada kengroq patofiziologik ta'rifini talab qiladi.
Turli xil AD biomarkerlariga bo'lgan favqulodda ehtiyojni hisobga olgan holda, soha biomarkerlarni kashf qilish uchun umumiy tizimga asoslangan "omiks" usulini tobora ko'proq qabul qilmoqda. Tezlashtirilgan farmatsevtika hamkorligi (AMP) - AD alyansi 2014-yilda ishga tushirilgan va dasturda yetakchi hisoblanadi. Milliy sog'liqni saqlash institutlari, akademiya va sanoatning ushbu ko'p tarmoqli sa'y-harakatlari AD patofiziologiyasini yaxshiroq aniqlash va bioxilma-xillikni diagnostika tahlili va davolash strategiyalarini ishlab chiqish uchun tizimga asoslangan strategiyalardan foydalanishga qaratilgan (10). Ushbu loyihaning bir qismi sifatida tarmoq proteomikasi ADda tizimga asoslangan biomarkerlarni rivojlantirish uchun istiqbolli vositaga aylandi. Ushbu xolis ma'lumotlarga asoslangan yondashuv murakkab proteomik ma'lumotlar to'plamlarini ma'lum hujayralar, organellalar va biologik funktsiyalar bilan bog'liq bo'lgan birgalikda ifodalangan oqsillarning guruhlari yoki "modullari" ga tashkil qiladi (11-13). AD miyasida deyarli 12 ta axborotga boy tarmoq proteomikasi tadqiqotlari o'tkazildi (13-23). Umuman olganda, ushbu tahlillar shuni ko'rsatadiki, AD miya tarmog'i proteomi mustaqil kogortalarda va bir nechta kortikal mintaqalarda yuqori darajada saqlangan modulli tashkilotni saqlaydi. Bundan tashqari, ushbu modullarning ba'zilari ma'lumotlar to'plamlari bo'ylab AD bilan bog'liq mo'l-ko'llikda takrorlanadigan o'zgarishlarni ko'rsatadi, bu ko'plab kasalliklarning patofiziologiyasini aks ettiradi. Birgalikda, ushbu topilmalar ADda tizimga asoslangan biomarker sifatida miya tarmog'i proteomasini kashf qilish uchun istiqbolli langar nuqtasini ko'rsatadi.
AD miya tarmog'i proteomini klinik jihatdan foydali tizimga asoslangan biomarkerlarga aylantirish uchun biz miyadan olingan tarmoqni AD CSF proteomik tahlili bilan birlashtirdik. Ushbu integratsiyalashgan yondashuv sinapslar, qon tomirlari, miyelinatsiya, yallig'lanish va metabolik yo'llarning disfunktsiyasini o'z ichiga olgan miyaga asoslangan patofiziologiyaning keng doirasi bilan bog'liq bo'lgan CSF biomarkerlarining beshta istiqbolli to'plamini aniqlashga olib keldi. Biz ushbu biomarker panellarini bir nechta replikatsiya tahlillari, shu jumladan turli neyrodegenerativ kasalliklardan olingan 500 dan ortiq CSF namunalari orqali muvaffaqiyatli tasdiqladik. Ushbu tekshirish tahlillari asemptomatik AD (AsymAD) bilan og'rigan bemorlarning CSFdagi guruh maqsadlarini tekshirishni yoki oddiy kognitiv muhitda amiloid to'planishining dalillarini ko'rsatishni o'z ichiga oladi. Ushbu tahlillar AsymAD populyatsiyasidagi muhim biologik heterojenlikni ta'kidlaydi va kasallikning dastlabki bosqichlarida shaxslarni subtipatsiyalashi mumkin bo'lgan panel belgilarini aniqlaydi. Umuman olganda, bu natijalar AD duch keladigan ko'plab klinik muammolarni muvaffaqiyatli hal qila oladigan bir nechta tizimlarga asoslangan protein biomarker vositalarini ishlab chiqishda muhim qadamdir.
Ushbu tadqiqotning asosiy maqsadi AD ga olib keladigan turli xil miyaga asoslangan patofiziologiyani aks ettiruvchi yangi miya omurilik suyuqligi biomarkerlarini aniqlashdir. S1-rasmda bizning tadqiqot metodologiyamiz ko'rsatilgan, u (i) miya bilan bog'liq bo'lgan bir nechta CSF kasalligi biomarkerlarini aniqlash uchun AD CSF va tarmoq miya proteomasining dastlabki topilmalari asosida keng qamrovli tahlilni va (ii) keyingi replikatsiyani o'z ichiga oladi. suyuqlik kogortalari. Kashfiyotga yo'naltirilgan tadqiqot Emori Goizueta Altsgeymer kasalligi tadqiqot markazida (ADRC) 20 kognitiv normal odamlarda va 20 AD bemorlarida CSFning differentsial ifodasini tahlil qilish bilan boshlandi. AD diagnostikasi miya omurilik suyuqligida past Aβ1-42 va umumiy tau va p-tau darajasining ko'tarilishi mavjudligida sezilarli kognitiv buzilish sifatida aniqlanadi [O'rtacha Monreal kognitiv baholash (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (S1A-jadval). Nazorat (o'rtacha MoCA, 26,7 ± 2,2) CSF biomarkerlarining normal darajasiga ega edi.
Inson CSF oqsil ko'pligining dinamik diapazoni bilan tavsiflanadi, unda albumin va boshqa juda ko'p proteinlar qiziqish uyg'otadigan oqsillarni aniqlashga to'sqinlik qilishi mumkin (24). Protein kashfiyoti chuqurligini oshirish uchun biz massa spektrometriyasi (MS) tahlilidan oldin har bir CSF namunasidan birinchi 14 ta juda ko'p oqsillarni olib tashladik (24). MS tomonidan jami 39 805 peptid aniqlangan, ular 40 ta namunadagi 3691 proteoma bilan xaritalangan. Protein miqdorini aniqlash bir nechta tandem massa yorlig'i (TMT) yorlig'i bilan amalga oshiriladi (18, 25). Yo'qolgan ma'lumotlarni hal qilish uchun biz keyingi tahlilda namunalarning kamida 50% miqdorida aniqlangan oqsillarni qo'shdik va nihoyat 2875 proteoma miqdorini aniqladik. Proteinning umumiy ko'pligi darajasidagi sezilarli farq tufayli, nazorat namunasi statistik jihatdan chetga surilgan (13) va keyingi tahlilga kiritilmagan. Qolgan 39 ta namunaning mo'l-ko'llik qiymatlari yosh, jins va partiya kovariatsiyasiga qarab o'zgartirildi (13-15, 17, 18, 20, 26).
Regressiya ma'lumotlari to'plamida differentsial ifodani baholash uchun statistik t-test tahlilidan foydalangan holda, ushbu tahlil nazorat va AD holatlari o'rtasida ko'plik darajasi sezilarli darajada o'zgargan (P <0,05) oqsillarni aniqladi (jadval S2A). 1A-rasmda ko'rsatilganidek, ADda jami 225 ta oqsilning ko'pligi sezilarli darajada kamaydi va 303 oqsilning ko'pligi sezilarli darajada oshdi. Bu differensial ravishda ifodalangan oqsillar orasida mikrotubulalar bilan bog'liq protein tau (MAPT; P = 3,52 × 10-8), neyrofilament (NEFL; P = 6,56 × 10-3), o'sish bilan bog'liq protein 43 kabi ilgari aniqlangan miya omurilik suyuqligining bir nechta AD belgilari kiradi. (GAP43; P = 1,46 × 10−5), yog 'kislotasini bog'lovchi oqsil 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), xitinaza 3 kabi 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Neyral granulin (NRGN; P = 3,43 × 10−4) va VGF nerv o'sish omili (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Shu bilan birga, biz boshqa juda muhim maqsadlarni ham aniqladik, masalan, YaIM dissotsiatsiya inhibitori 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) va SPARC bilan bog'liq modulli kaltsiy bog'lash 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9) . Gen ontologiyasi (GO) 225 ta sezilarli darajada kamaygan oqsillarni tahlil qilish steroid almashinuvi, qon ivishi va gormonlar faolligi kabi tanadagi suyuqlik jarayonlari bilan yaqin aloqalarni aniqladi (1B-rasm va S2B-jadval). Aksincha, 303 ning sezilarli darajada ko'tarilgan oqsili hujayra tuzilishi va energiya almashinuvi bilan chambarchas bog'liq.
(A) Vulqon grafigi t-testi orqali olingan -log10 statistik P qiymatiga (y-o'qi) nisbatan log2 marta o'zgarishini (x o'qi) ko'rsatadi, bu nazorat (CT) va differensial ifodani aniqlash uchun ishlatiladi. Barcha oqsillarning CSF proteomasining AD holatlari. AD darajasida sezilarli darajada kamaygan oqsillar (P <0,05) ko'k rangda, kasallik darajasi sezilarli darajada oshgan oqsillar esa qizil rangda ko'rsatilgan. Tanlangan protein etiketlanadi. (B) Protein bilan bog'liq eng yuqori GO atamalari ADda sezilarli darajada kamayadi (ko'k) va ko'tariladi (qizil). Biologik jarayonlar, molekulyar funktsiyalar va hujayra komponentlari sohalarida eng yuqori z ballga ega uchta GO atamasini ko'rsatadi. (C) MS CSF namunasidagi MAPT darajasini o'lchadi (chapda) va uning namunadagi Elishay tau darajasi bilan bog'liqligi (o'ngda). Tegishli P qiymatiga ega Pearson korrelyatsiya koeffitsienti ko'rsatiladi. Bitta AD holati uchun Elishay ma'lumotlari yo'qligi sababli, bu raqamlar tahlil qilingan 39 ta holatdan 38 tasi uchun qiymatlarni o'z ichiga oladi. (D) Nazorat ostidagi klaster tahlili (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) P <0.01 sozlangan) nazorat va AD CSF maʼlumotlar toʻplamidagi 65 ta eng sezilarli darajada oʻzgargan oqsillardan foydalangan holda namunalar topildi. Standartlashtirish, normallashtirish.
MAPT ning proteomik darajasi mustaqil ravishda o'lchangan Elishay tau darajasi bilan chambarchas bog'liq (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; 1C-rasm), bizning MS o'lchovimizning haqiqiyligini qo'llab-quvvatlaydi. Amiloid prekursor oqsili (APP) darajasida tripsin hazm bo'lgandan so'ng, Ab1-40 va Ab1-42 ning C-terminaliga joylashtirilgan izoformga xos peptidlarni samarali ionlash mumkin emas (27, 28). Shuning uchun biz aniqlagan APP peptidlari ELISA Ab1-42 darajalariga hech qanday aloqasi yo'q. Har bir holatning differentsial ifodasini baholash uchun biz namunalarning nazorat ostida klaster tahlilini o'tkazish uchun P <0,0001 [noto'g'ri kashfiyot darajasi (FDR) tuzatilgan P <0,01] bilan differentsial ravishda ifodalangan oqsillardan foydalandik (jadval S2A). 1D-rasmda ko'rsatilganidek, ushbu 65 ta juda muhim oqsillar namunalarni kasallik holatiga ko'ra to'g'ri to'plashi mumkin, nazoratga o'xshash xususiyatlarga ega bo'lgan bitta AD holati bundan mustasno. Ushbu 65 ta oqsildan 63 tasi ADda ortdi, faqat ikkitasi (CD74 va ISLR) kamaydi. Umuman olganda, bu miya omurilik suyuqligi tahlillari ADda kasallikning biomarkerlari bo'lishi mumkin bo'lgan yuzlab oqsillarni aniqladi.
Keyin biz AD miya proteomining mustaqil tarmoq tahlilini o'tkazdik. Ushbu kashfiyotning miya kohortiga nazoratdan olingan dorsolateral prefrontal korteks (DLPFC) (n = 10), Parkinson kasalligi (PD; n = 10), aralash AD / PD (n = 10) va AD (n = 10) holatlari kiritilgan. ) Namuna. Emeri Goizueta ADRC. Ushbu 40 ta holatning demografiyasi ilgari tasvirlangan (25) va S1B jadvalida umumlashtirilgan. Biz TMT-MS dan ushbu 40 ta miya to'qimalarini va 27 ta holatning replikatsiya kohortasini tahlil qilish uchun foydalandik. Hammasi bo'lib, ushbu ikkita miya ma'lumotlar to'plami 227 121 noyob peptidlarni ishlab chiqardi, ular 12 943 proteomaga (25) moslashtirildi. Faqat kamida 50% hollarda miqdori aniqlangan oqsillar keyingi tadqiqotlarga kiritilgan. Yakuniy kashfiyot ma'lumotlar to'plamida 8817 miqdoriy oqsil mavjud. Yosh, jins va o'limdan keyingi interval (PMI) asosida protein ko'pligi darajasini sozlang. Regressiyadan so'ng ma'lumotlar to'plamining differentsial ifoda tahlili shuni ko'rsatdiki, ikki yoki undan ortiq kasallik kohortlarida> 2000 protein darajasi sezilarli darajada o'zgargan [P <0,05, dispersiya tahlili (ANOVA)]. Keyin, biz differentsial ravishda ifodalangan oqsillarga asoslangan nazorat ostida klaster tahlilini o'tkazdik va AD/nazorat va/yoki AD/PD taqqoslashlarida P <0,0001 (rasm S2, A va B, jadval S2C). Ushbu 165 ta yuqori darajada o'zgartirilgan oqsillar nazorat va PD namunalarida AD patologiyasi bo'lgan holatlarni aniq tasvirlab beradi, bu esa butun proteomadagi kuchli ADga xos o'zgarishlarni tasdiqlaydi.
Keyin kashf etilgan miya proteomasida tarmoq tahlilini o'tkazish uchun Weighted Gen Co-Expression Network Analysis (WGCNA) deb nomlangan algoritmdan foydalandik, bu ma'lumotlar to'plamini o'xshash ifoda naqshlari bilan protein modullariga tashkil qiladi (11-13). Tahlil 44 modulni (M) birgalikda ifodalangan oqsillarni aniqladi, ular eng kattadan (M1, n = 1821 oqsil) eng kichigigacha (M44, n = 34 oqsil) tartiblangan va raqamlangan (2A-rasm va S2D-jadval) ). Yuqorida aytib o'tilganidek (13) Har bir modulning vakili ifoda profilini yoki xarakterli oqsilni hisoblang va uni kasallik holati va AD patologiyasi bilan bog'lang, ya'ni Altsgeymer kasalliklari registri (CERAD) va Braak balli ittifoqini o'rnating (2B-rasm). Umuman olganda, 17 modul AD nevropatologiyasi bilan sezilarli darajada bog'liq edi (P <0,05). Kasallik bilan bog'liq bo'lgan ushbu modullarning aksariyati hujayra turiga xos belgilarga boy (2B-rasm). Yuqorida aytib o'tilganidek (13), hujayra turini boyitish modulning bir-biriga mos kelishini va hujayra turiga xos genlarning mos yozuvlar ro'yxatini tahlil qilish orqali aniqlanadi. Ushbu genlar izolyatsiya qilingan sichqoncha neyronlari, endotelial va glial hujayralardagi nashr etilgan ma'lumotlardan olingan. RNK ketma-ketligi (RNK-seq) tajribasi (29).
(A) Miya proteomasining WGCNA ni kashf qiling. (B) AD nevropatologik xarakteristikalari (yuqorida), jumladan CERAD (Ab blyashka) va Braak (tau chigallari) ballari bilan modulli imzo oqsilining (modulli oqsil ifodasining birinchi asosiy komponenti) ikki vaznli o'rta korrelyatsiya (BiCor) tahlili. Ijobiy (qizil) va salbiy (ko'k) korrelyatsiyalarning intensivligi ikki rangli issiqlik xaritasi bilan ko'rsatilgan va yulduzchalar statistik ahamiyatga ega (P <0,05). Har bir protein modulining hujayra turi assotsiatsiyasini baholash uchun Gipergeometrik Fisherning aniq testidan (FET) (pastki) foydalaning. Qizil soyaning intensivligi hujayra turini boyitish darajasini ko'rsatadi va yulduzcha statistik ahamiyatga ega (P <0,05). FETdan olingan P qiymatini tuzatish uchun BH usulidan foydalaning. (C) Modulli oqsillarni GO tahlili. Har bir modul yoki tegishli modul guruhi uchun eng yaqin biologik jarayonlar ko'rsatilgan. oligo, oligodendrosit.
Beshta chambarchas bog'liq astrosit va mikrogliyaga boy modullar to'plami (M30, M29, M18, M24 va M5) AD nevropatologiyasi bilan kuchli ijobiy korrelyatsiyani ko'rsatdi (2B-rasm). Ontologik tahlil ushbu glial modullarni hujayra o'sishi, ko'payishi va immuniteti bilan bog'laydi (2C-rasm va S2E-jadval). Ikki qo'shimcha glial modul M8 va M22 ham kasallikda kuchli tartibga solinadi. M8 tug'ma immunitet reaktsiyasida asosiy rol o'ynaydigan signal kaskadi bo'lgan Toll-like retseptorlari yo'li bilan juda bog'liq (30). Shu bilan birga, M22 post-translational modifikatsiya bilan chambarchas bog'liq. Oligodendrositlarga boy bo'lgan M2 AD patologiyasi bilan kuchli ijobiy korrelyatsiyani va nukleozidlar sintezi va DNK replikatsiyasi bilan ontologik aloqani ko'rsatadi, bu kasalliklarda hujayra proliferatsiyasining kuchayganligini ko'rsatadi. Umuman olganda, ushbu topilmalar AD tarmog'i proteomida biz ilgari kuzatgan glial modullarning balandligini qo'llab-quvvatlaydi (13, 17). Hozirgi vaqtda tarmoqdagi AD bilan bog'liq ko'plab glial modullar nazorat va PD holatlarida past ifoda darajalarini ko'rsatishi aniqlandi, bu ularning ADda yuqori bo'lgan kasallikning o'ziga xosligini ta'kidlaydi (S2C-rasm).
Tarmoq proteomimizdagi faqat to'rtta modul (M1, M3, M10 va M32) AD patologiyasi bilan kuchli salbiy bog'liqdir (P <0,05) (2-rasm, B va C). M1 ham, M3 ham neyron belgilariga boy. M1 sinaptik signallar bilan, M3 esa mitoxondrial funktsiya bilan chambarchas bog'liq. M10 va M32 uchun hujayra turini boyitish haqida hech qanday dalil yo'q. M32 M3 va hujayra metabolizmi o'rtasidagi bog'liqlikni aks ettiradi, M10 esa hujayra o'sishi va mikrotubulalar funktsiyasi bilan juda bog'liq. AD bilan solishtirganda, barcha to'rtta modul nazorat va PDda ko'payadi, bu ularga kasallikka xos AD o'zgarishlarini beradi (S2C-rasm). Umuman olganda, bu natijalar biz ilgari ADda kuzatgan neyronga boy modullar sonining kamayishini qo'llab-quvvatlaydi (13, 17). Xulosa qilib aytganda, biz kashf etgan miya proteomasining tarmoq tahlili oldingi topilmalarimizga mos keladigan AD uchun maxsus o'zgartirilgan modullarni ishlab chiqardi.
AD erta asemptomatik bosqich (AsymAD) bilan tavsiflanadi, bunda odamlarda klinik kognitiv pasayishsiz amiloid to'planishi kuzatiladi (5, 31). Ushbu asemptomatik bosqich erta aniqlash va aralashuv uchun juda muhim oynadir. Biz ilgari mustaqil ma'lumotlar to'plamlarida AsymAD va AD miya tarmog'i proteomining kuchli modulli saqlanishini ko'rsatdik (13, 17). Biz hozirda kashf etgan miya tarmog'i ushbu oldingi topilmalar bilan mos kelishini ta'minlash uchun biz 27 ta DLPFC tashkilotining takrorlangan ma'lumotlar to'plamida 44 modulning saqlanishini tahlil qildik. Ushbu tashkilotlar nazorat (n = 10), AsymAD (n = 8) va AD (n = 9) holatlarini o'z ichiga oladi. Nazorat va AD namunalari bizning kashfiyot miya kohortimiz tahliliga kiritilgan (jadval S1B), AsymAD holatlari esa faqat replikatsiya kohortida noyob edi. Ushbu AsymAD holatlari Emory Goizueta ADRC miya bankidan ham kelgan. O'lim vaqtida bilish normal bo'lsa-da, amiloid darajalari anormal darajada yuqori edi (o'rtacha CERAD, 2,8 ± 0,5) (jadval S1B).
Ushbu 27 miya to'qimalarining TMT-MS tahlili natijasida 11 244 proteoma miqdori aniqlandi. Ushbu yakuniy hisob faqat namunalarning kamida 50% miqdorida aniqlangan oqsillarni o'z ichiga oladi. Ushbu takrorlangan ma'lumotlar to'plami bizning kashfiyotimiz miya tahlilida aniqlangan 8817 oqsilning 8638 tasini (98,0%) o'z ichiga oladi va nazorat va AD kogortalari o'rtasida 3000 ga yaqin sezilarli darajada o'zgargan oqsillarga ega (P <0,05, dispersiyani tahlil qilish uchun Tukeyning juftlashtirilgan t testidan keyin) ( Jadval S2F). Ushbu differentsial tarzda ifodalangan oqsillar orasida 910 ham AD va miya proteomini nazorat qilish holatlari o'rtasida sezilarli darajadagi o'zgarishlarni ko'rsatdi (P <0,05, ANOVA Tukey juftlashtirilgan t-testidan keyin). Shuni ta'kidlash kerakki, bu 910 markerlar proteomalar orasidagi o'zgarish yo'nalishi bo'yicha juda mos keladi (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (S3A-rasm). Ko'paygan oqsillar orasida ma'lumotlar to'plamlari orasidagi eng izchil o'zgarishlarga ega bo'lgan oqsillar, asosan, glialga boy M5 va M18 modullari (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 va GFAP) a'zolaridir. Kamaytirilgan oqsillar orasida eng barqaror o'zgarishlarga ega bo'lganlar deyarli faqat sinaps bilan bog'liq M1 modulining (NPTX2, VGF va RPH3A) a'zolari edi. Biz qo'shimcha ravishda o'rta miya (MDK), CD44, ajralib chiqadigan jingalak bilan bog'liq protein 1 (SFRP1) va VGF ning AD bilan bog'liq o'zgarishlarini western blotting orqali tekshirdik (rasm S3B). Modulni saqlash tahlili shuni ko'rsatdiki, miya proteomasidagi oqsil modullarining taxminan 80% (34/44) replikatsiya ma'lumotlar to'plamida sezilarli darajada saqlanib qolgan (z-score> 1,96, FDR tuzatilgan P <0,05) (S3C-rasm). Ushbu modullarning o'n to'rttasi ikkita proteoma o'rtasida maxsus ajratilgan (z-score> 10, FDR tuzatilgan P <1,0 × 10−23). Umuman olganda, miya proteomasi o'rtasidagi differentsial ifoda va modul tarkibidagi yuqori darajadagi izchillikning kashf etilishi va takrorlanishi AD frontal korteks oqsillaridagi o'zgarishlarning takrorlanishini ta'kidlaydi. Bundan tashqari, AsymAD va yanada rivojlangan kasalliklar juda o'xshash miya tarmog'i tuzilishiga ega ekanligini tasdiqladi.
Miya replikatsiyasi ma'lumotlari to'plamidagi differensial ifodaning batafsil tahlili AsymAD oqsili o'zgarishining sezilarli darajasini, shu jumladan AsymAD va nazorat o'rtasida sezilarli darajada o'zgargan 151 ta oqsilni ta'kidlaydi (P <0,05) (S3D-rasm). Amiloid yukiga mos ravishda, AsymAD va AD miyasida APP sezilarli darajada oshdi. MAPT faqat ADda sezilarli darajada o'zgaradi, bu chalkashliklar darajasining oshishiga va uning kognitiv pasayish bilan ma'lum korrelyatsiyasiga mos keladi (5, 7). Glialga boy modullar (M5 va M18) AsymADdagi oqsillarning ko'payishida yuqori darajada aks etadi, neyron bilan bog'liq M1 moduli esa AsymADdagi kamaygan oqsillarning eng vakili hisoblanadi. Ushbu AsymAD belgilarining ko'pchiligi simptomatik kasalliklarda ko'proq o'zgarishlarni ko'rsatadi. Ushbu belgilar orasida miya shishi va ko'zlar va oyoq-qo'llarning rivojlanishi bilan bog'liq bo'lgan M18 ga tegishli glial oqsil bo'lgan SMOC1 mavjud (32). MDK hujayra o'sishi va angiogenez bilan bog'liq bo'lgan geparinni bog'laydigan o'sish omili (33), M18 ning yana bir a'zosi. Nazorat guruhi bilan solishtirganda, AsymAD sezilarli darajada oshdi, keyin esa AD ko'proq o'sdi. Aksincha, sinaptik protein neyropentraksin 2 (NPTX2) AsymAD miyasida sezilarli darajada kamaydi. NPTX2 ilgari neyrodegeneratsiya bilan bog'liq bo'lgan va qo'zg'atuvchi sinapslarda vositachilik qilishda tan olingan rolga ega (34). Umuman olganda, bu natijalar ADda kasallikning og'irligiga qarab o'sib boruvchi turli xil preklinik protein o'zgarishlarini ko'rsatadi.
Miya proteomasini kashf qilishda biz oqsil qoplamining sezilarli chuqurligiga erishganimizni hisobga olsak, biz uning tarmoq darajasidagi AD transkriptomi bilan mos kelishini to'liqroq tushunishga harakat qilmoqdamiz. Shuning uchun biz kashf etgan miya proteomini AD (n = 308) va nazorat (n = 157) DLPFC to'qimalarida (13) 18 204 genning mikroarray o'lchovidan ilgari yaratilgan modul bilan solishtirdik. ustma-ust tushadigan. Hammasi bo'lib, biz 20 xil RNK modullarini aniqladik, ularning ko'pchiligi neyronlar, oligodendrositlar, astrositlar va mikrogliyalarni o'z ichiga olgan ma'lum hujayra turlarining boyitilishini ko'rsatdi (3A-rasm). Ushbu modullarning ADdagi bir nechta o'zgarishlari 3B-rasmda ko'rsatilgan. Chuqurroq yorliqsiz MS proteomasi (taxminan 3000 ta oqsil) (13) yordamida oldingi oqsil-RNK oʻzaro bogʻliqligi tahliliga mos kelsak, biz topgan miya proteoma tarmogʻidagi 44 modulning aksariyati transkriptom tarmogʻida. Hech qanday muhim oʻxshashlik yoʻq. Bizning kashfiyotimiz va miya proteomasida yuqori darajada saqlanadigan 34 ta protein modulining replikatsiyasi, faqat 14 tasi (~ 40%) Fisherning aniq testidan (FET) o'tdi, transkriptom bilan statistik jihatdan ahamiyatli o'xshashligini isbotladi (3A-rasm). DNK shikastlanishini tuzatish (P-M25 va P-M19), oqsillarni tarjima qilish (P-M7 va P-M20), RNKni bog'lash/splaysing (P-M16 va P-M21) va oqsilni nishonga olish (P-M13 va P-) bilan mos keladi. M23) transkriptomdagi modullar bilan bir-biriga mos kelmaydi. Shu sababli, joriy takrorlash tahlilida (13) chuqurroq proteom ma'lumotlar to'plami ishlatilgan bo'lsa-da, AD tarmog'i proteomining ko'p qismi transkriptom tarmog'iga moslashtirilmagan.
(A) Gipergeometrik FET AD transkriptomining (yuqorida) RNK modulida hujayra turiga xos belgilarning boyitilganligini va AD miyasining RNK (x o'qi) va oqsil (y o'qi) modullari o'rtasidagi o'xshashlik darajasini ko'rsatadi. (pastki). Qizil soyaning intensivligi yuqori paneldagi hujayra turlarini boyitish darajasini va pastki paneldagi modullarning bir-biriga yopishish intensivligini ko'rsatadi. Yulduzchalar statistik ahamiyatga ega ekanligini ko'rsatadi (P <0,05). (B) Har bir transkriptom modulining xarakterli genlari va AD holati o'rtasidagi bog'liqlik darajasi. Chapdagi modullar AD (ko'k) bilan eng salbiy, o'ngdagilar esa AD (qizil) bilan eng ijobiy bog'liqdir. Log-transformatsiyalangan BH-tuzatilgan P qiymati har bir korrelyatsiyaning statistik ahamiyatlilik darajasini ko'rsatadi. (C) Birgalikda hujayra turini boyitish bilan bir-biriga mos keladigan modullar. (D) Bir-birining ustiga chiqadigan modulda etiketli oqsil (x o'qi) va RNK (y o'qi) ning log2 marta o'zgarishining korrelyatsiya tahlili. Tegishli P qiymatiga ega Pearson korrelyatsiya koeffitsienti ko'rsatiladi. Mikro, mikrogliya; samoviy jismlar, astrositlar. KT, nazorat.
Aksariyat bir-biriga o'xshash oqsil va RNK modullari o'xshash hujayra tipidagi boyitish profillarini va izchil AD o'zgarishlar yo'nalishlarini taqsimlaydi (3-rasm, B va C). Boshqacha qilib aytganda, miya proteomasining sinaps bilan bog'liq M1 moduli (PM1) ADda joylashgan uchta neyronlarga boy gomologik RNK modullari (R-M1, R-M9 va R-M16) bilan taqqoslanadi. pasaytirilgan daraja. Xuddi shunday, glialga boy M5 va M18 oqsil modullari astrositlarga va mikroglial belgilarga (R-M3, R-M7 va R-M10) boy RNK modullari bilan mos keladi va kasalliklarning kuchayishida yuqori darajada ishtirok etadi. Ikki ma'lumot to'plami o'rtasidagi umumiy modulli xususiyatlar hujayralar turini boyitish va biz miya proteomasida kuzatilgan kasallik bilan bog'liq o'zgarishlarni qo'llab-quvvatlaydi. Biroq, biz ushbu umumiy modullarda individual markerlarning RNK va oqsil darajalari o'rtasida juda ko'p sezilarli farqlarni kuzatdik. Ushbu bir-biriga o'xshash modullar ichidagi molekulalarning proteomikasi va transkriptomikasining differentsial ifodasini korrelyatsiya tahlili (3D-rasm) bu nomuvofiqlikni ta'kidlaydi. Misol uchun, APP va boshqa bir qancha glial modul oqsillari (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 va SFRP1) AD proteomasida sezilarli o'sishni ko'rsatdi, ammo AD transkriptomida deyarli hech qanday o'zgarish bo'lmadi. Proteinga xos bo'lgan bu o'zgarishlar amiloid plitalari bilan chambarchas bog'liq bo'lishi mumkin (23, 35), patologik o'zgarishlar manbai sifatida proteomani ta'kidlaydi va bu o'zgarishlar transkriptomda aks ettirilmasligi mumkin.
Biz kashf etgan miya va CSF proteomlarini mustaqil ravishda tahlil qilgandan so'ng, biz miya tarmog'ining patofiziologiyasi bilan bog'liq bo'lgan AD CSF biomarkerlarini aniqlash uchun ikkita ma'lumot to'plamini keng qamrovli tahlil qildik. Biz birinchi navbatda ikkita proteomaning bir-biriga mos kelishini aniqlashimiz kerak. CSF AD miyasida neyrokimyoviy o'zgarishlarni aks ettirishi keng qabul qilingan bo'lsa-da (4), AD miyasi va CSF proteomasi o'rtasidagi o'xshashlikning aniq darajasi aniq emas. Ikki proteomamizda aniqlangan umumiy gen mahsuloti sonini taqqoslab, biz miya omurilik suyuqligida aniqlangan oqsillarning deyarli 70% (n = 1936) miyada ham aniqlanganligini aniqladik (4A-rasm). Ushbu bir-biriga o'xshash oqsillarning ko'pchiligi (n = 1721) kashfiyot miya ma'lumotlar to'plamidan 44 ta birgalikda ifodalash modullaridan biriga joylashtirilgan (4B-rasm). Kutilganidek, oltita eng katta miya modullari (M1 dan M6) eng ko'p miqdordagi CSF o'xshashligini ko'rsatdi. Biroq, kichikroq miya modullari (masalan, M15 va M29) mavjud bo'lib, ular kutilmagan darajada yuqori darajadagi o'zaro bog'lanishga erishadilar, miya modulidan ikki baravar kattaroqdir. Bu bizni miya va miya omurilik suyuqligi o'rtasidagi o'zaro bog'liqlikni hisoblash uchun batafsilroq, statistik usulni qo'llashga undaydi.
(A va B) kashfiyot miyasida aniqlangan oqsillar va CSF ma'lumotlar to'plamlari bir-biriga mos keladi. Ushbu bir-biriga o'xshash oqsillarning aksariyati miyaning birgalikda ifodalash tarmog'ining 44 ta koekspression modullaridan biri bilan bog'liq. (C) Miya omurilik suyuqligi proteomasi va miya tarmog'i proteomasi o'rtasidagi o'zaro bog'liqlikni aniqlang. Issiqlik xaritasining har bir qatori gipergeometrik FETning alohida o'zaro tahlilini ifodalaydi. Yuqori qatorda miya moduli va butun CSF proteomi o'rtasidagi o'zaro bog'liqlik (kulrang/qora soya) tasvirlangan. Ikkinchi qatorda miya modullari va CSF oqsili (qizil rang bilan qoplangan) o'rtasidagi o'zaro bog'liqlik ADda sezilarli darajada yuqori tartibga solinganligini ko'rsatadi (P <0,05). Uchinchi qator miya modullari va CSF oqsili (ko'k soya) o'rtasidagi o'zaro bog'liqlik ADda sezilarli darajada pasayganligini ko'rsatadi (P <0,05). FETdan olingan P qiymatini tuzatish uchun BH usulidan foydalaning. (D) Hujayra turi assotsiatsiyasi va tegishli GO shartlariga asoslangan katlanuvchi modul paneli. Ushbu panellar CSF proteomasida mazmunli differentsial ifodaga ega bo'lgan jami 271 ta miya bilan bog'liq oqsillarni o'z ichiga oladi.
Yagona dumli FETlardan foydalanib, biz CSF proteomasi va individual miya modullari o'rtasidagi oqsillarning bir-biriga mos kelishining ahamiyatini baholadik. Tahlil shuni ko'rsatdiki, CSF ma'lumotlar to'plamidagi jami 14 ta miya moduli statistik jihatdan muhim o'xshashliklarga ega (FDR sozlangan P <0,05) va qo'shimcha modul (M18), ularning bir-biriga mos kelishi ahamiyatlilikka yaqin (FDR sozlangan P = 0,06) (4C-rasm). , yuqori qator). Biz, shuningdek, differensial ravishda ifodalangan CSF oqsillari bilan bir-biriga mos keladigan modullarga qiziqamiz. Shuning uchun, biz (i) CSF oqsilining qaysi biri ADda sezilarli darajada oshganligini va (ii) CSF oqsilining ADda sezilarli darajada kamayganligini aniqlash uchun ikkita qo'shimcha FET tahlilini qo'lladik (P <0,05, juftlashtirilgan t testi AD/nazorat) Miya modullari mazmunli o'xshashlik bilan. ular orasida. 4C-rasmning o'rta va pastki qatorlarida ko'rsatilganidek, ushbu qo'shimcha tahlillar shuni ko'rsatadiki, 44 ta miya modulidan 8 tasi AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 va M38) qo'shilgan oqsil bilan sezilarli darajada mos keladi. . ), faqat ikkita modul (M6 va M15) AD CSFdagi kamaytirilgan oqsil bilan mazmunli o'xshashlikni ko'rsatdi. Kutilganidek, barcha 10 modul CSF proteomasi bilan eng yuqori mos keladigan 15 modulda joylashgan. Shuning uchun biz ushbu 15 modul AD miyasidan olingan CSF biomarkerlarining yuqori rentabellikdagi manbalari deb hisoblaymiz.
Biz ushbu 15 ta bir-biriga o'xshash modullarni WGCNA daraxt diagrammasidagi yaqinligi va ularning hujayra turlari va gen ontologiyasi bilan bog'lanishiga asoslanib, beshta katta protein paneliga yig'dik (4D-rasm). Birinchi panelda neyron belgilari va sinaps bilan bog'liq oqsillarga boy modullar mavjud (M1 va M12). Sinaptik panel jami 94 ta oqsilni o'z ichiga oladi va CSF proteomasidagi darajalar sezilarli darajada o'zgarib, beshta panel orasida miya bilan bog'liq CSF belgilarining eng katta manbaiga aylandi. Ikkinchi guruh (M6 va M15) "yaralarni davolash" (M6) va "gumoral immun javobni tartibga solish" (M15) kabi endotelial hujayra belgilari va qon tomir tanasi bilan yaqin aloqani ko'rsatdi. M15, shuningdek, endoteliy bilan chambarchas bog'liq bo'lgan lipoprotein metabolizmi bilan juda bog'liq (36). Qon tomir panelida miyaga tegishli 34 ta CSF belgilari mavjud. Uchinchi guruh oligodendrosit belgilari va hujayra proliferatsiyasi bilan sezilarli darajada bog'liq bo'lgan modullarni (M2 va M4) o'z ichiga oladi. Masalan, M2 ning yuqori darajadagi ontologik atamalariga "DNK replikatsiyasining ijobiy regulyatsiyasi" va "purin biosintezi jarayoni" kiradi. Shu bilan birga, M4 ga "glial hujayralar differentsiatsiyasi" va "xromosomalarni ajratish" kiradi. Miyelinatsiya panelida miyaga tegishli 49 ta CSF belgilari mavjud.
To'rtinchi guruh eng ko'p modullarni o'z ichiga oladi (M30, M29, M18, M24 va M5) va deyarli barcha modullar mikrogliya va astrosit belgilariga sezilarli darajada boy. Miyelinatsiya paneliga o'xshab, to'rtinchi panelda ham hujayra proliferatsiyasi bilan chambarchas bog'liq bo'lgan modullar (M30, M29 va M18) mavjud. Ushbu guruhdagi boshqa modullar "immun ta'sir jarayoni" (M5) va "immun javobni tartibga solish" (M24) kabi immunologik atamalar bilan juda bog'liq. Glial immun guruhida miyaga tegishli 42 ta CSF belgilari mavjud. Va nihoyat, oxirgi panelda to'rtta modulda (M44, M3, M33 va M38) miya bilan bog'liq 52 ta marker mavjud bo'lib, ularning barchasi energiyani saqlash va metabolizm bilan bog'liq. Ushbu modullarning eng kattasi (M3) mitoxondriya bilan chambarchas bog'liq va neyronga xos belgilarga boy. M38 ushbu metabolomning kichik modul a'zolaridan biri bo'lib, shuningdek, o'rtacha neyron o'ziga xosligini namoyish etadi.
Umuman olganda, bu beshta panel AD korteksidagi hujayra turlari va funktsiyalarining keng doirasini aks ettiradi va birgalikda 271 miya bilan bog'liq CSF markerlarini o'z ichiga oladi (jadval S2G). Ushbu MS natijalarining to'g'riligini baholash uchun biz ortogonal antikorga asoslangan texnologiya, multiplekslash qobiliyati, yuqori sezuvchanlik va o'ziga xoslikka ega bo'lgan yaqinlikni kengaytirish tahlilidan (PEA) foydalandik va miya omurilik suyuqligi namunalarini qayta tahlil qildik. (n = 36). Ushbu 36 ta maqsad MSga asoslangan topilmalar bilan chambarchas bog'liq bo'lgan PEA ning AD ko'pligidagi o'zgarishlarni ko'rsatadi (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), bu bizning keng qamrovli MS tahlilimiz natijalarini tasdiqladi (S4-rasm). ).
Sinaptik signalizatsiyadan energiya almashinuvigacha bo'lgan besh guruhimiz tomonidan ta'kidlangan biologik mavzularning barchasi AD patogenezi bilan bog'liq (1-3). Shu sababli, ushbu panellarni o'z ichiga olgan barcha 15 modul biz kashf etgan miya proteomasida AD patologiyasi bilan bog'liq (2B-rasm). Eng diqqatga sazovor narsa bu bizning glial modullarimiz o'rtasidagi yuqori ijobiy patologik korrelyatsiya va eng katta neyron modullarimiz (M1 va M3) o'rtasidagi kuchli salbiy patologik korrelyatsiya. Bizning replikatsiya qilingan miya proteomasining differentsial ekspressiv tahlili (S3D-rasm) M5 va M18-dan olingan glial oqsillarni ham ta'kidlaydi. AsymAD va simptomatik ADda eng ko'p ko'paygan glial oqsillar va M1 bilan bog'liq sinapslar Protein eng ko'p kamayadi. Ushbu kuzatishlar shuni ko'rsatadiki, biz beshta guruhda aniqlagan 271 ta miya omurilik suyuqligi belgilari AD korteksidagi kasallik jarayonlari, shu jumladan erta asemptomatik bosqichlarda yuzaga keladigan kasalliklar bilan bog'liq.
Miya va orqa miya suyuqligidagi panel oqsillarining o'zgarish yo'nalishini yaxshiroq tahlil qilish uchun biz 15 ta bir-biriga o'xshash modullarning har biri uchun quyidagilarni chizdik: (i) miya ma'lumotlar to'plamida modul ko'pligi darajasini va (ii) modul oqsil Farq miya omurilik suyuqligida ifodalanadi (S5-rasm). Yuqorida aytib o'tilganidek, WGCNA miyadagi modul ko'pligini yoki xarakterli protein qiymatini aniqlash uchun ishlatiladi (13). Vulkan xaritasi miya omurilik suyuqligidagi modulli oqsillarning differentsial ifodasini tasvirlash uchun ishlatiladi (AD/nazorat). Ushbu raqamlar beshta paneldan uchtasi miya va orqa miya suyuqligidagi turli ifoda tendentsiyalarini ko'rsatadi. Sinaps panelining ikkita moduli (M1 va M12) AD miyasida mo'l-ko'llik darajasining pasayishini ko'rsatadi, ammo AD CSFdagi ortib borayotgan oqsil bilan sezilarli darajada mos keladi (S5A-rasm). Metabolomni o'z ichiga olgan neyron bilan bog'liq modullar (M3 va M38) shunga o'xshash miya va miya omurilik suyuqligining bir-biriga mos kelmasligini ko'rsatdi (S5E-rasm). Qon tomir paneli, shuningdek, turli xil ifoda tendentsiyalarini ko'rsatdi, garchi uning modullari (M6 va M15) AD miyasida o'rtacha darajada oshgan va kasal bo'lgan CSFda kamaygan (S5B-rasm). Qolgan ikkita panel katta glial tarmoqlarni o'z ichiga oladi, ularning oqsillari ikkala bo'linmada ham doimiy ravishda yuqori tartibga solinadi (S5, C va D-rasm).
Shuni esda tutingki, bu tendentsiyalar ushbu panellardagi barcha markerlar uchun umumiy emas. Misol uchun, sinaptik panel AD miya va CSFda sezilarli darajada kamaygan bir nechta oqsillarni o'z ichiga oladi (S5A-rasm). Bu pastga regulyatsiya qilingan miya omurilik suyuqligi belgilari orasida NPTX2 va M1 VGF va M12 xromogranin B mavjud. Biroq, ushbu istisnolarga qaramay, bizning sinaptik belgilarimizning aksariyati AD orqa miya suyuqligida ko'tariladi. Umuman olganda, ushbu tahlillar bizning beshta panelimizning har birida miya va miya omurilik suyuqligi darajasidagi statistik jihatdan muhim tendentsiyalarni ajrata oldi. Ushbu tendentsiyalar ADda miya va CSF oqsillari ifodasi o'rtasidagi murakkab va ko'pincha turli xil munosabatlarni ta'kidlaydi.
Keyinchalik, biz 271 biomarkerlar to'plamini eng istiqbolli va takrorlanadigan maqsadlarga qisqartirish uchun yuqori samarali MS replikatsiya tahlilidan (CSF replikatsiyasi 1) foydalandik (5A-rasm). CSF 1 nusxasi Emory Goizueta ADRC dan jami 96 ta namunani o'z ichiga oladi, shu jumladan nazorat, AsymAD va AD kohorti (jadval S1A). Ushbu AD holatlari engil kognitiv pasayish (o'rtacha MoCA, 20,0 ± 3,8) va miya omurilik suyuqligida tasdiqlangan AD biomarkerlarining o'zgarishi (jadval S1A) bilan tavsiflanadi. Biz aniqlagan CSF tahlilidan farqli o'laroq, bu replikatsiya yanada samarali va yuqori mahsuldorlikka ega "bir martalik" MS usuli (of-layn fraksiyalashsiz), shu jumladan individual namunalarning immunitetini yo'qotish zaruratini bartaraf etadigan soddalashtirilgan namuna tayyorlash protokoli yordamida amalga oshiriladi. . Buning o'rniga, kam miqdorda oqsillar signalini kuchaytirish uchun immunitetni zaiflashtiradigan yagona "kuchaytirish kanali" ishlatiladi (37). Garchi u proteomning umumiy qamrovini kamaytirsa-da, bu bir martalik usul mashina vaqtini sezilarli darajada qisqartiradi va hayotiyligini tahlil qilish mumkin bo'lgan TMT etiketli namunalar sonini oshiradi (17, 38). Hammasi bo'lib, tahlil 96 ta holatda 1183 ta proteomani o'z ichiga olgan 6 487 ta peptidni aniqladi. Biz topilgan CSF tahlilida bo'lgani kabi, faqat namunalarning kamida 50% miqdorida ko'rsatilgan oqsillar keyingi hisob-kitoblarga kiritilgan va ma'lumotlar yosh va jinsning ta'siri uchun regressiya qilingan. Bu 792 ta proteomaning yakuniy miqdorini aniqlashga olib keldi, ularning 95 foizi topilgan CSF ma'lumotlar to'plamida ham aniqlangan.
(A) Miya bilan bog'liq CSF protein maqsadlari birinchi takrorlangan CSF kohortida tasdiqlangan va yakuniy panelga kiritilgan (n = 60). (B dan E gacha) to'rtta CSF replikatsiya kogortalarida o'lchangan panel biomarker darajalari (kompozit z-ballari). Har bir takroriy tahlilda ko'plikdagi o'zgarishlarning statistik ahamiyatini baholash uchun juftlashtirilgan t-testlar yoki Tukeyning post-tuzatish bilan ANOVA ishlatilgan. KT, nazorat.
Biz miya bilan bog'liq bo'lgan 271 CSF maqsadlarini har tomonlama tahlil qilish orqali tekshirishga ayniqsa qiziqqanimiz sababli, biz ushbu replikatsiya qilingan proteomani keyingi tekshirishni ushbu markerlar bilan cheklaymiz. Ushbu 271 ta oqsil orasida 100 tasi CSF replikatsiyasida aniqlangan. ADda sinaptik va metabolit gistonlari eng ko'p ortadi, kasallikda esa qon tomir oqsillari eng ko'p kamayadi. 100 ta bir-biriga o'xshash belgilarning ko'pchiligi (n = 70) ikkita ma'lumot to'plamida bir xil o'zgarish yo'nalishini saqlab qoldi (S6B-rasm). Ushbu 70 ta tasdiqlangan miya bilan bog'liq CSF markerlari (jadval S2H) asosan ilgari kuzatilgan panel ifodasi tendentsiyalarini aks ettiradi, ya'ni qon tomir oqsillarini pastga regulyatsiyasi va boshqa barcha panellarning yuqori regulyatsiyasi. Ushbu tasdiqlangan 70 ta oqsildan faqat 10 tasi AD ko'pligidagi o'zgarishlarni ko'rsatdi, bu panel tendentsiyalariga zid keladi. Miya va miya omurilik suyuqligining umumiy tendentsiyasini eng yaxshi aks ettiruvchi panelni yaratish uchun biz ushbu 10 ta oqsilni nihoyat tekshirgan qiziqish panelidan chiqarib tashladik (5A-rasm). Shu sababli, bizning panelimiz oxir-oqibatda turli xil namunalarni tayyorlash va MS platformasi tahlilidan foydalangan holda ikkita mustaqil CSF AD kohortlarida tasdiqlangan jami 60 ta oqsilni o'z ichiga oladi. CSF nusxasi 1 nazorati va AD holatlaridagi ushbu yakuniy panellarning z-skorli ifoda syujetlari biz topgan CSF kohortida kuzatilgan panel tendentsiyasini tasdiqladi (5B-rasm).
Ushbu 60 ta oqsillar orasida AD bilan bog'liq bo'lgan molekulalar mavjud, masalan, osteopontin (SPP1), bu yallig'lanishga qarshi sitokin bo'lib, ko'plab tadqiqotlarda AD bilan bog'langan (39-41) va GAP43, sinaptik oqsil. Bu aniq neyrodegeneratsiya bilan bog'liq (42). Eng to'liq tasdiqlangan oqsillar amyotrofik lateral skleroz (ALS) bilan bog'liq superoksid dismutaza 1 (SOD1) va Parkinson kasalligi bilan bog'liq desaxaraza (PARK7) kabi boshqa neyrodegenerativ kasalliklar bilan bog'liq markerlardir. Shuningdek, biz SMOC1 va miyaga boy membrana biriktiruvchi signalizatsiya oqsili 1 (BASP1) kabi ko'plab boshqa belgilarning neyrodejeneratsiya bilan oldingi aloqalari cheklanganligini tasdiqladik. Shuni ta'kidlash kerakki, ularning CSF proteomasida umumiy ko'pligi pastligi sababli, MAPT va boshqa ba'zi AD bilan bog'liq oqsillarni (masalan, NEFL va NRGN) ishonchli aniqlash uchun ushbu yuqori o'tkazuvchanlikdagi bir martalik aniqlash usulidan foydalanish biz uchun qiyin. ) ( 43, 44).
Keyin biz ushbu 60 ta ustuvor panel belgilarini uchta qo'shimcha takroriy tahlilda tekshirdik. CSF Copy 2-da biz Emory Goizueta ADRC (17) dan 297 nazorat va AD namunalaridan iborat mustaqil kohortni tahlil qilish uchun bitta TMT-MS dan foydalandik. CSF replikatsiyasi 3 Shveytsariyaning Lozanna shahridan (45) 120 nazorat va AD bemorlarining mavjud TMT-MS ma'lumotlarini qayta tahlil qilishni o'z ichiga oladi. Biz har bir maʼlumotlar toʻplamidagi 60 ta ustuvor belgilarning uchdan ikki qismidan koʻprogʻini aniqladik. Shveytsariya tadqiqotida turli xil MS platformalari va TMT miqdorini aniqlash usullaridan foydalanilgan bo'lsa-da (45, 46), biz panel tendentsiyalarini ikkita takroriy tahlilda (5-rasm, C va D va S2, I va J jadvallari) kuchli takrorladik. Guruhimizning kasallikning o'ziga xosligini baholash uchun biz to'rtinchi replikatsiya ma'lumotlar to'plamini (CSF replikatsiyasi 4) tahlil qilish uchun TMT-MS dan foydalandik, bu nafaqat nazorat (n = 18) va AD (n = 17) holatlarini, balki PD ( n = 14)), ALS (n = 18) va frontotemporal demans (FTD) namunalari (n = 11) (jadval S1A). Biz ushbu kohortdagi panel oqsillarining deyarli uchdan ikki qismini muvaffaqiyatli aniqladik (60 tadan 38 tasi). Ushbu natijalar barcha besh biomarker panelidagi ADga xos o'zgarishlarni ta'kidlaydi (5E-rasm va S2K-jadval). Metabolitlar guruhining o'sishi eng kuchli AD o'ziga xosligini ko'rsatdi, keyin miyelinatsiya va glial guruh. Kamroq darajada, FTD ushbu panellar orasidagi o'sishni ham ko'rsatadi, bu tarmoqdagi o'xshash potentsial o'zgarishlarni aks ettirishi mumkin (17). Aksincha, ALS va PD nazorat guruhi bilan deyarli bir xil miyelinatsiya, glial va metabolom profillarini ko'rsatdi. Umuman olganda, namunalarni tayyorlash, MS platformasi va TMT miqdorini aniqlash usullaridagi farqlarga qaramay, ushbu takroriy tahlillar bizning ustuvor panel belgilarimiz 500 dan ortiq noyob CSF namunalarida yuqori darajada izchil ADga xos o'zgarishlarga ega ekanligini ko'rsatadi.
AD neyrodegeneratsiyasi kognitiv simptomlar boshlanishidan bir necha yil oldin keng tarqalgan, shuning uchun AsymAD biomarkerlariga shoshilinch ehtiyoj bor (5, 31). Biroq, tobora ko'proq dalillar AsymAD biologiyasi bir hil emasligini ko'rsatmoqda va xavf va chidamlilikning murakkab o'zaro ta'siri kasallikning keyingi rivojlanishida katta individual farqlarga olib keladi (47). Garchi AsymAD holatlarini aniqlash uchun foydalanilgan bo'lsa-da, asosiy CSF biomarkerlari (Ab1-42, total tau va p-tau) darajasi kim demansga o'tishini ishonchli tarzda bashorat qila olmasligini isbotlamadi (4, 7), bu ko'proq bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. Ushbu populyatsiyaning xavfini aniq tabaqalash uchun miya fiziologiyasining ko'p jihatlariga asoslangan yaxlit biomarker vositalarini kiritish zarur. Shu sababli, biz keyinchalik CSF 1 nusxasining AsymAD populyatsiyasida AD tomonidan tasdiqlangan biomarker panelimizni tahlil qildik. Ushbu 31 AsymAD holatlarida g'ayritabiiy asosiy biomarker darajalari (Ab1–42 / umumiy tau ELISA nisbati, <5,5) va to'liq bilish (o'rtacha MoCA, 27,1) ko'rsatilgan. ± 2.2) (S1A-jadval). Bundan tashqari, AsymAD bo'lgan barcha shaxslar 0 ga teng klinik demans balliga ega, bu kundalik kognitiv yoki funktsional ko'rsatkichlarning pasayishi haqida hech qanday dalil yo'qligini ko'rsatadi.
Biz birinchi bo'lib AsymAD kohortini o'z ichiga olgan barcha 96 CSF replikatsiyasida tasdiqlangan panellar darajasini tahlil qildik. Biz AsymAD guruhidagi bir nechta panellarda sezilarli ADga o'xshash ko'p o'zgarishlarga ega ekanligini aniqladik, qon tomir paneli AsymADda pasayish tendentsiyasini ko'rsatdi, boshqa barcha panellar esa ko'tarilish tendentsiyasini ko'rsatdi (6A-rasm). Shu sababli, barcha panellar Elishay Ab1-42 va umumiy tau darajalari bilan juda muhim korrelyatsiyani ko'rsatdi (6B-rasm). Aksincha, guruh va MoCA reytingi o'rtasidagi bog'liqlik nisbatan yomon. Ushbu tahlillarning eng hayratlanarli topilmalaridan biri bu AsymAD kohortidagi panellarning ko'pligi. 6A-rasmda ko'rsatilganidek, AsymAD guruhining panel darajasi odatda nazorat guruhi va AD guruhining panel darajasini kesib, nisbatan yuqori o'zgaruvchanlikni ko'rsatadi. AsymAD ning ushbu heterojenligini yanada o'rganish uchun biz 96 CSF replikatsiyasi 1 holatiga Ko'p o'lchovli Scaling (MDS) tahlilini qo'lladik. MDS tahlili ma'lumotlar to'plamidagi ma'lum o'zgaruvchilarga asoslangan holatlar o'rtasidagi o'xshashlikni tasavvur qilish imkonini beradi. Ushbu klaster tahlili uchun biz faqat CSF kashfiyoti va replikatsiya 1 proteom (n = 29) (S2L jadvali) darajasida statistik jihatdan muhim o'zgarishlarga (P <0,05, AD/nazorat) ega bo'lgan tasdiqlangan panel belgilaridan foydalanamiz. Ushbu tahlil bizning nazoratimiz va AD holatlari o'rtasida aniq fazoviy klaster hosil qildi (6C-rasm). Aksincha, ba'zi AsymAD holatlari nazorat guruhida aniq klasterlangan, boshqalari esa AD holatlarida joylashgan. Ushbu AsymAD heterojenligini yanada o'rganish uchun biz ushbu AsymAD holatlarining ikkita guruhini aniqlash uchun MDS xaritamizdan foydalandik. Birinchi guruh nazoratga yaqinroq bo'lgan AsymAD holatlarini o'z ichiga olgan (n = 19), ikkinchi guruh esa AD ga yaqinroq bo'lgan marker profiliga ega AsymAD holatlari bilan tavsiflangan (n = 12).
(A) CSF replikatsiya 1 kohortidagi barcha 96 ta namunadagi CSF biomarker guruhining ifoda darajasi (z-skor), shu jumladan AsymAD. Panelning ko'pligi o'zgarishlarining statistik ahamiyatini baholash uchun Tukeyning post-tuzatish bilan dispersiya tahlili ishlatilgan. (B) Elishay Ab1-42 va CSF nusxasi 1 namunalarida MoCA balli va umumiy tau darajasi bilan panel oqsilining ko'pligi darajasining korrelyatsiya tahlili (z-skor). Tegishli P qiymatiga ega Pearson korrelyatsiya koeffitsienti ko'rsatiladi. (C) 96 ta CSF nusxasi 1 holatlarining MDS 29 ta tasdiqlangan panel markerlarining ko'plik darajalariga asoslangan bo'lib, ular ham kashfiyotda, ham CSF nusxasi 1 ma'lumotlar to'plamlarida sezilarli darajada o'zgartirildi [P <0,05 AD/nazorat (CT)]. Ushbu tahlil AsymAD guruhini nazorat (n = 19) va AD (n = 12) kichik guruhlarga bo'lish uchun ishlatilgan. (D) Vulqon syujeti ikkita AsymAD kichik guruhlari orasidagi -log10 statistik P qiymatiga nisbatan log2 marta o'zgarishi (x o'qi) bilan barcha CSF replikatsiyasi 1 oqsillarining differentsial ifodasini ko'rsatadi. Panelning biomarkerlari rangli. (E) CSF replikatsiyasi Tanlash guruhi biomarkerlarining 1-ko'plik darajasi AsymAD kichik guruhlari o'rtasida differentsial tarzda ifodalanadi. Statistik ahamiyatlilikni baholash uchun Tukeyning keyingi tuzatilgan dispersiya tahlili ishlatilgan.
Biz ushbu nazorat va AD-ga o'xshash AsymAD holatlari o'rtasidagi differentsial protein ifodasini ko'rib chiqdik (6D-rasm va S2L-jadval). Olingan vulqon xaritasi shuni ko'rsatadiki, 14 ta panel belgilari ikki guruh o'rtasida sezilarli darajada o'zgargan. Ushbu belgilarning aksariyati sinaps va metabolomning a'zolaridir. Shu bilan birga, mos ravishda miyelin va glial immun guruhlari a'zolari bo'lgan SOD1 va miristillangan alaninga boy protein kinaz S substrati (MARCKS) ham ushbu guruhga tegishli (6-rasm, D va E). Qon tomir paneli, shuningdek, ADga o'xshash AsymAD guruhida sezilarli darajada kamaygan ikkita markerga hissa qo'shdi, jumladan AE bog'lovchi protein 1 (AEBP1) va to'ldiruvchi oila a'zosi C9. ELISA AB1-42 (P = 0.38) va p-tau (P = 0.28) da nazorat va AD-ga o'xshash AsymAD kichik guruhlari o'rtasida sezilarli farq yo'q edi, lekin haqiqatan ham umumiy tau darajasida (P = 0,0031) sezilarli farq bor edi. ) (S7-rasm). Ikkita AsymAD kichik guruhi o'rtasidagi o'zgarishlar umumiy tau darajalaridan (masalan, YWHAZ, SOD1 va MDH1) muhimroq ekanligini ko'rsatadigan bir nechta panel belgilari mavjud (6E-rasm). Umuman olganda, bu natijalar bizning tasdiqlangan panelimiz asemptomatik kasalligi bo'lgan bemorlarning pastki turi va potentsial xavf tabaqalanishiga olib keladigan biomarkerlarni o'z ichiga olishi mumkinligini ko'rsatadi.
AD ortidagi turli patofiziologiyani yaxshiroq o'lchash va maqsadli yo'naltirish uchun tizimga asoslangan biomarker vositalariga shoshilinch ehtiyoj bor. Ushbu vositalar nafaqat bizning AD diagnostika tizimini o'zgartirishi, balki samarali, bemorga xos davolash strategiyalarini qabul qilishga yordam berishi kutilmoqda (1, 2). Shu maqsadda biz miyaga asoslangan patofiziologiyaning keng doirasini aks ettiruvchi veb-asoslangan CSF biomarkerlarini aniqlash uchun AD miya va CSFga xolis keng qamrovli proteomik yondashuvni qo'lladik. Bizning tahlilimiz beshta CSF biomarker panelini ishlab chiqardi, ular (i) sinapslarni, qon tomirlarini, miyelinni, immun va metabolik disfunktsiyani aks ettiradi; (ii) turli MS platformalarida kuchli takrorlanuvchanlikni namoyish etish; (iii) AD ning erta va kech bosqichlarida progressiv kasallikka xos o'zgarishlarni ko'rsatish. Umuman olganda, ushbu topilmalar AD tadqiqotlari va klinik ilovalar uchun turli xil, ishonchli, vebga yo'naltirilgan biomarker vositalarini ishlab chiqish yo'lidagi istiqbolli qadamdir.
Natijalarimiz AD miya tarmog'i proteomasining yuqori darajada saqlanib qolgan tashkilotini ko'rsatadi va uni tizimga asoslangan biomarkerlarni ishlab chiqish uchun langar sifatida foydalanishni qo'llab-quvvatlaydi. Bizning tahlilimiz shuni ko'rsatadiki, AD va AsymAD miyalarini o'z ichiga olgan ikkita mustaqil TMT-MS ma'lumotlar to'plami kuchli modullikka ega. Ushbu topilmalar oldingi ishimizni kengaytirib, frontal, parietal va temporal korteksdagi bir nechta mustaqil kogortalardan 2000 dan ortiq miya to'qimalarining kuchli modullari saqlanib qolganligini ko'rsatadi (17). Ushbu konsensus tarmog'i hozirgi tadqiqotlarda kuzatilgan kasallik bilan bog'liq turli xil o'zgarishlarni, shu jumladan glialga boy yallig'lanish modullarining ko'payishini va neyronga boy modullarning kamayishini aks ettiradi. Joriy tadqiqotlar singari, ushbu keng ko'lamli tarmoq AsymAD-da turli xil preklinik patofiziologiyani ko'rsatadigan muhim modulli o'zgarishlarga ega (17).
Biroq, bu juda konservativ tizimga asoslangan doirada, ayniqsa, ADning dastlabki bosqichlarida shaxslar orasida nozik taneli biologik heterojenlik mavjud. Bizning biomarker panelimiz AsymAD-da ikkita kichik guruhni tasvirlay oladi, ular bir nechta CSF markerlarining sezilarli differentsial ifodasini namoyish etadi. Bizning guruhimiz ADning asosiy biomarkerlari darajasida aniq bo'lmagan ushbu ikki kichik guruh o'rtasidagi biologik farqlarni ajratib ko'rsatishga muvaffaq bo'ldi. Nazorat guruhi bilan taqqoslaganda, bu AsymAD shaxslarining Ab1-42 / umumiy tau nisbati g'ayritabiiy darajada past edi. Biroq, ikkita AsymAD kichik guruhi o'rtasida faqat umumiy tau darajalari sezilarli darajada farq qilgan, Ab1-42 va p-tau darajalari esa nisbatan taqqoslangan. Yuqori CSF tau AB1-42 darajalariga (7) qaraganda kognitiv simptomlarni yaxshiroq bashorat qiluvchi bo'lib tuyulganligi sababli, biz AsymAD kogortalarining kasallikning rivojlanishining turli xil xavflariga ega bo'lishi mumkinligiga shubha qilamiz. Bizning AsymAD ning cheklangan namuna hajmini va bo'ylama ma'lumotlarning etishmasligini hisobga olgan holda, ushbu xulosalarni ishonchli tarzda chiqarish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi. Biroq, bu natijalar shuni ko'rsatadiki, tizimga asoslangan CSF paneli kasallikning asemptomatik bosqichida odamlarni samarali tabaqalash qobiliyatimizni oshirishi mumkin.
Umuman olganda, bizning topilmalarimiz AD patogenezida bir nechta biologik funktsiyalarning rolini qo'llab-quvvatlaydi. Biroq, tartibga solinmagan energiya almashinuvi barcha tasdiqlangan beshta etiketka panelimizning asosiy mavzusiga aylandi. Gipoksantin-guanin fosforiboziltransferaza 1 (HPRT1) va laktat dehidrogenaza A (LDHA) kabi metabolik oqsillar eng ishonchli tasdiqlangan sinaptik biomarkerlar bo'lib, AD CSF ning o'sishi yuqori takrorlanadigan jinsiy aloqa ekanligini ko'rsatadi. Bizning qon tomirlarimiz va glial panellarimiz ham oksidlovchi moddalar almashinuvida ishtirok etadigan bir nechta belgilarni o'z ichiga oladi. Ushbu topilmalar nafaqat neyronlarning yuqori energiya talabini qondirish uchun, balki astrositlar va boshqa glial hujayralarning yuqori energiya talabini qondirish uchun butun miyada metabolik jarayonlar o'ynaydigan asosiy rolga mos keladi (17, 48). Natijalarimiz redoks potentsialidagi o'zgarishlar va energiya yo'llarining uzilishi AD patogenezida ishtirok etadigan bir nechta asosiy jarayonlar, jumladan mitoxondriyal kasalliklar, glial vositachilik va qon tomirlari shikastlanishi o'rtasidagi asosiy bog'liqlik bo'lishi mumkinligi haqidagi tobora ortib borayotgan dalillarni qo'llab-quvvatlaydi (49). Bundan tashqari, metabolik miya omurilik suyuqligi biomarkerlari bizning nazoratimiz va AD ga o'xshash AsymAD kichik guruhlari o'rtasida ko'p miqdorda differensial jihatdan boy oqsillarni o'z ichiga oladi, bu esa ushbu energiya va redoks yo'llarining buzilishi kasallikning preklinik bosqichida muhim bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.
Biz kuzatgan turli xil miya va miya omurilik suyuqligi panellari tendentsiyalari ham qiziqarli biologik ta'sirga ega. Neyronlarga boy sinapslar va metabolomlar AD miyasida darajalarning pasayishini va miya omurilik suyuqligining ko'pligini ko'rsatadi. Neyronlarning ko'p sonli maxsus signallarini energiya bilan ta'minlash uchun sinapslarda energiya ishlab chiqaruvchi mitoxondriyalarga boy ekanligini hisobga olsak (50), bu ikki neyron guruhining ifoda profillarining o'xshashligi kutilmoqda. Neyronlarning yo'qolishi va shikastlangan hujayralarning ekstruziyasi keyingi kasallikning ushbu miya va CSF paneli tendentsiyalarini tushuntirishi mumkin, ammo ular biz kuzatgan dastlabki panel o'zgarishlarini tushuntira olmaydi (13). Erta asemptomatik kasallikdagi bu topilmalar uchun mumkin bo'lgan tushuntirishlardan biri anormal sinaptik kesishdir. Sichqoncha modellarining yangi dalillari shuni ko'rsatadiki, mikroglia vositachiligidagi sinaptik fagotsitoz ADda g'ayritabiiy tarzda faollashishi va miyada sinapsning erta yo'qolishiga olib kelishi mumkin (51). Ushbu tashlab ketilgan sinaptik material CSFda to'planishi mumkin, shuning uchun biz neyron panelida CSFning ko'payishini kuzatamiz. Immunitet vositasida sinaptik kesish, shuningdek, kasallik jarayonida miya va miya omurilik suyuqligida kuzatadigan glial oqsillarning ko'payishini qisman tushuntirishi mumkin. Sinaptik kesishdan tashqari, ekzositik yo'lning umumiy anormalliklari neyron belgilarining turli xil miya va CSF ifodalariga olib kelishi mumkin. Bir qator tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, AD miya patogenezida ekzosomalar tarkibi o'zgargan (52). Hujayradan tashqari yo'l ham Ab proliferatsiyasida ishtirok etadi (53, 54). Shuni ta'kidlash kerakki, ekzosomal sekretsiyani bostirish AD transgenik sichqon modellarida ADga o'xshash patologiyani kamaytirishi mumkin (55).
Shu bilan birga, qon tomir panelidagi oqsil AD miyasida o'rtacha o'sishni ko'rsatdi, ammo CSFda sezilarli darajada kamaydi. Qon-miya to'sig'i (BBB) disfunktsiyasi bu topilmalarni qisman tushuntirishi mumkin. Ko'pgina mustaqil o'limdan keyingi inson tadqiqotlari ADda BBB parchalanishini ko'rsatdi (56, 57). Ushbu tadqiqotlar endotelial hujayralarning mahkam yopilgan qatlami atrofida turli xil g'ayritabiiy harakatlarni tasdiqladi, shu jumladan miya kapillyarlarining oqishi va qon orqali o'tadigan oqsillarning perivaskulyar to'planishi (57). Bu miyadagi qon tomir oqsillarining ko'tarilishi uchun oddiy tushuntirish berishi mumkin, ammo miya omurilik suyuqligida xuddi shu oqsillarning kamayishini to'liq tushuntirib bera olmaydi. Ehtimollardan biri shundaki, markaziy asab tizimi yallig'lanish va oksidlovchi stressning kuchayishi muammosini hal qilish uchun ushbu molekulalarni faol ravishda ajratib turadi. Ushbu paneldagi ba'zi eng og'ir CSF oqsillarining kamayishi, ayniqsa lipoproteinlarni tartibga solishda ishtirok etadiganlar, yallig'lanishning zararli darajalarini va reaktiv kislorod turlarining neyroprotektiv jarayonini inhibe qilish bilan bog'liq. Bu qon aylanishidagi oksidlovchi stress darajasini pasaytirish uchun mas'ul bo'lgan lipoproteinlarni bog'lovchi ferment bo'lgan Paroksonaz 1 (PON1) uchun amal qiladi (58, 59). Alfa-1-mikroglobulin/bikunin prekursori (AMBP) qon tomir guruhining yana bir sezilarli darajada pastga regulyatsiya qilingan belgisidir. Bu lipid tashuvchi bikuninning kashshofi bo'lib, u yallig'lanishni bostirish va nevrologik himoyada ham ishtirok etadi (60, 61).
Turli xil qiziqarli farazlarga qaramay, biokimyoviy kasallik mexanizmlarini to'g'ridan-to'g'ri aniqlashning mumkin emasligi kashfiyotga asoslangan proteomik tahlilning taniqli cheklovidir. Shu sababli, ushbu biomarker panellari orqasidagi mexanizmlarni ishonchli aniqlash uchun keyingi tadqiqotlar zarur. MSga asoslangan klinik tahlilni rivojlantirishga o'tish uchun kelajakdagi yo'nalish, shuningdek, tanlab yoki parallel reaktsiya monitoringi kabi keng ko'lamli biomarkerlarni tekshirish uchun maqsadli miqdoriy usullardan foydalanishni talab qiladi (62). Biz yaqinda bu erda tasvirlangan ko'plab CSF oqsil o'zgarishlarini tasdiqlash uchun parallel reaktsiya monitoringini (63) ishlatdik. Bir nechta ustuvor panel maqsadlari muhim aniqlik bilan aniqlanadi, jumladan YWHAZ, ALDOA va SMOC1, ular mos ravishda sinaps, metabolizm va yallig'lanish panellari bilan taqqoslanadi (63). Ma'lumotlarni mustaqil yig'ish (DIA) va boshqa MS-ga asoslangan strategiyalar ham maqsadni tekshirish uchun foydali bo'lishi mumkin. Bud va boshqalar. (64) Yaqinda bizning CSF kashfiyoti ma'lumotlar to'plamimizda aniqlangan AD biomarkerlari va mustaqil DIA-MS ma'lumotlar to'plami o'rtasida sezilarli o'xshashlik mavjudligi ko'rsatildi, bu uch xil Evropa kogortalaridan 200 ga yaqin CSF namunalaridan iborat. Ushbu so'nggi tadqiqotlar bizning panellarimizni ishonchli MS-ga asoslangan aniqlashga aylantirish potentsialini qo'llab-quvvatlaydi. An'anaviy antikor va aptamerga asoslangan aniqlash AD asosiy biomarkerlarini yanada rivojlantirish uchun ham muhimdir. CSF ning kam ko'pligi tufayli, yuqori samarali MS usullari yordamida ushbu biomarkerlarni aniqlash qiyinroq. NEFL va NRGN - bu kam miqdordagi CSF biomarkerlarining ikkita namunasi bo'lib, ular bizning keng qamrovli tahlilimizda panelga kiritilgan, ammo bizning yagona MS strategiyamiz yordamida ishonchli tarzda aniqlanmaydi. PEA kabi bir nechta antikorlarga asoslangan maqsadli strategiyalar ushbu belgilarning klinik o'zgarishiga yordam berishi mumkin.
Umuman olganda, ushbu tadqiqot turli tizimlar asosida CSF AD biomarkerlarini aniqlash va tekshirish uchun noyob proteomik yondashuvni taqdim etadi. Ushbu marker panellarini qo'shimcha AD kogortalari va MS platformalarida optimallashtirish AD xavfini tabaqalash va davolashni rivojlantirish uchun istiqbolli bo'lishi mumkin. Vaqt o'tishi bilan ushbu panellarning bo'ylama darajasini baholaydigan tadqiqotlar, shuningdek, markerlarning qaysi kombinatsiyasi erta kasallik xavfini va kasallikning zo'ravonligidagi o'zgarishlarni eng yaxshi tabaqalashini aniqlash uchun juda muhimdir.
CSF tomonidan nusxalangan 3 ta namunadan tashqari, ushbu tadqiqotda foydalanilgan barcha CSF namunalari Emory ADRC yoki yaqindan bog'liq tadqiqot institutlari homiyligida to'plangan. Ushbu proteomik tadqiqotlarda Emory CSF namunalarining jami to'rtta to'plami ishlatilgan. CSF kohortida 20 sog'lom nazorat va 20 AD bemorlaridan namunalar borligi aniqlandi. CSF 1 nusxasi 32 sog'lom nazorat, 31 AsymAD va 33 AD shaxslar namunalarini o'z ichiga oladi. CSF 2 nusxasi 147 ta nazorat va 150 AD namunalarini o'z ichiga oladi. Ko'p kasallikli CSF replikatsiyasi 4 kohorti 18 ta nazorat, 17 AD, 19 ALS, 13 PD va 11 FTD namunalarini o'z ichiga olgan. Emori universiteti institutsional ko'rib chiqish kengashi tomonidan tasdiqlangan kelishuvga ko'ra, Emori tadqiqotining barcha ishtirokchilari xabardor qilingan rozilikni olishdi. 2014-yilgi Altsgeymer markazlari uchun qarish bo‘yicha eng yaxshi amaliyot bo‘yicha Milliy institut ko‘rsatmalariga ko‘ra (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), miya omurilik suyuqligi lomber ponksiyon orqali to‘plangan va saqlanadi. Nazorat va AsymAD va AD bemorlari Emory Kognitiv Nevrologiya Klinikasi yoki Goizueta ADRC da standartlashtirilgan kognitiv baholashni oldilar. Ularning miya omurilik suyuqligi namunalari INNO-BIA AlzBio3 Luminex tomonidan ELISA Ab1-42, umumiy tau va p-tau tahlillari (65) uchun sinovdan o'tkazildi. Elishay qiymatlari ob'ektlarning diagnostik tasnifini qo'llab-quvvatlash uchun AD biomarkerining belgilangan mezonlari asosida qo'llaniladi (66, 67). Boshqa CSF tashxislari (FTD, ALS va PD) uchun asosiy demografik va diagnostika ma'lumotlari ham Emory ADRC yoki unga aloqador tadqiqot institutlaridan olinadi. Ushbu Emory CSF holatlari uchun umumiy holat metama'lumotlarini S1A jadvalida topish mumkin. Shveytsariya CSF replikatsiyasi 3 kohortining xususiyatlari ilgari nashr etilgan (45).
CSF namunani topdi. CSF ma'lumotlar to'plamini kashf qilish chuqurligini oshirish uchun tripsinizatsiyadan oldin ko'p miqdorda oqsillarni immunologik iste'mol qilish amalga oshirildi. Muxtasar qilib aytganda, 40 ta individual CSF namunalaridan 130 mkl CSF va teng hajmdagi (130 mkl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion qatroni (Thermo Fisher Scientific, A36372) aylanish ustuniga (Thermo Fisher Scientific, A89868) joylashtirildi. harorat inkubatsiya). 15 daqiqa aylantirgandan so'ng, namunani 1000 g da 2 daqiqa davomida santrifüj qiling. 3K ultratsentrifugal filtri qurilmasi (Millipore, UFC500396) oqava suv namunasini 30 daqiqa davomida 14,000 g santrifüjlash orqali konsentratsiyalash uchun ishlatilgan. Barcha namuna hajmlarini 75 mkl gacha fosfatli buferli sho'r suv bilan suyultiring. Protein konsentratsiyasi ishlab chiqaruvchining protokoliga (Thermo Fisher Scientific) muvofiq bicinchoninic kislota (BCA) usuli bilan baholandi. Barcha 40 ta namunadagi immunitet tanqisligi bo'lgan CSF (60 mkl) lizil endopeptidaza (LysC) va tripsin bilan hazm qilindi. Qisqacha aytganda, namuna 10 daqiqa davomida 90 ° C da 1,2 mkl 0,5 M tris-2 (-karboksietil)-fosfin va 3 mkl 0,8 M xloroasetamid bilan kamaytirildi va alkillashtirildi va keyin 15 daqiqa davomida suv hammomida sonikatsiya qilindi. Namuna 193 mkl 8 M karbamid buferi [8 M karbamid va 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] bilan yakuniy 6 M karbamid konsentratsiyasigacha suyultirildi. LysC (4,5 mkg; Wako) xona haroratida bir kechada hazm qilish uchun ishlatiladi. Keyin namuna 50 mM ammoniy bikarbonat (ABC) bilan 1 M karbamidgacha suyultirildi (68). Teng miqdorda (4,5 mkg) tripsin (Promega) qo'shing va keyin namunani 12 soat davomida inkubatsiya qiling. Hazm qilingan peptid eritmasini 1% chumoli kislotasi (FA) va 0,1% triftorasetik kislota (TFA) ning yakuniy konsentratsiyasiga qadar kislotalang (66), so'ngra yuqorida tavsiflanganidek 50 mg Sep-Pak C18 kolonnasi (suvlar) bilan tuzsizlantiring (25) . Keyin peptid 1 ml 50% asetonitrilda (ACN) suzildi. To'plamlar (25) bo'yicha oqsil miqdorini standartlashtirish uchun barcha 40 CSF namunalaridan 100 mkl alikotlar aralash namuna hosil qilish uchun birlashtirildi, so'ngra beshta global ichki standart (GIS) (48) namunaga bo'lingan. Barcha individual namunalar va birlashtirilgan standartlar yuqori tezlikda vakuumda (Labconco) quritiladi.
CSF namunadan nusxa oladi. Dayon va uning hamkasblari ilgari immunitetning pasayishi va CSF 3 nusxasining hazm bo'lishini tasvirlashgan (45, 46). Qolgan replikatsiya namunalari individual ravishda immunitetni yo'qotmagan. Ushbu olib tashlanmagan namunalarni yuqorida tavsiflanganidek tripsinda hazm qiling (17). Har bir takroriy tahlil uchun har bir namunadan 120 mkl elimit peptid alikotlari birlashtirildi va TMT etiketli global ichki standart sifatida foydalanish uchun teng hajmli alikvotlarga bo'lingan (48). Barcha individual namunalar va birlashtirilgan standartlar yuqori tezlikda vakuumda (Labconco) quritiladi. Kam miqdordagi CSF oqsilining signalini kuchaytirish uchun har bir namunadan 125 mklni birlashtirib, har bir takroriy tahlil uchun "kengaytirilgan" namuna tayyorlandi [ya'ni, tadqiqot namunasini taqlid qiladigan biologik namuna, ammo mavjud miqdor ancha kattaroq (37, 69)] aralash CSF namunasiga birlashtirildi (17). Keyin aralash namuna 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal qatroni (Thermo Fisher Scientific, A36372) yordamida immunoremovatsiya qilindi, yuqorida tavsiflanganidek hazm qilindi va keyingi bir nechta TMT yorlig'iga kiritildi.
Yuborilgan vaqt: 27-avgust, 2021-yil