Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydi. Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScript-ni ishlatmasdan taqdim etamiz.
Termofillar yuqori haroratda rivojlanadigan mikroorganizmlardir. Ularni o'rganish hayotning ekstremal sharoitlarga qanday moslashishi haqida qimmatli ma'lumotlarni berishi mumkin. Biroq, an'anaviy optik mikroskoplar bilan yuqori harorat sharoitlariga erishish qiyin. Mahalliy rezistiv elektr isitishga asoslangan bir nechta uy qurilishi echimlari taklif qilingan, ammo oddiy tijorat yechimi yo'q. Ushbu maqolada biz mikroskopning ko'rish maydoni bo'ylab mikro miqyosli lazerli isitish kontseptsiyasini kiritamiz, shu bilan birga termofil tadqiqotlari uchun yuqori haroratni ta'minlash va foydalanuvchining muhitini yumshoq saqlash. O'rtacha lazer intensivligida mikro miqyosda isitishga oltin nanozarrachalar bilan qoplangan substrat yordamida biomos keluvchi va samarali yorug'lik yutuvchi sifatida erishish mumkin. Mikro o'lchovli suyuqlik konvektsiyasi, hujayralarni ushlab turish va markazdan qochma termoforetik harakatning mumkin bo'lgan ta'siri muhokama qilinadi. Usul ikki turda ko'rsatildi: (i) Geobacillus stearothermophilus, faol termofil bakteriya, taxminan 65 ° C da ko'payadi, biz mikro miqyosda isitish ostida unib chiqishi, o'sishi va suzishini kuzatdik; (ii) Thiobacillus sp., optimal gipertermofil arxeya. 80 ° C da. Ushbu ish zamonaviy va arzon mikroskopiya vositalaridan foydalangan holda termofil mikroorganizmlarni oddiy va xavfsiz kuzatish uchun yo'l ochadi.
Milliardlab yillar davomida Yerdagi hayot bizning inson nuqtai nazarimizdan ba'zan ekstremal deb hisoblangan atrof-muhit sharoitlarining keng doirasiga moslashish uchun rivojlandi. Xususan, termofillar deb ataladigan ba'zi termofil mikroorganizmlar (bakteriyalar, arxeyalar, zamburug'lar) 45 ° C dan 122 ° C gacha bo'lgan harorat oralig'ida ko'payadi1, 2, 3, 4. Termofillar turli xil ekotizimlarda, masalan, chuqur dengiz gidrotermal teshiklarida, issiq buloqlarda yashaydi. yoki vulqon zonalari. Ularning tadqiqotlari so'nggi bir necha o'n yilliklarda kamida ikki sababga ko'ra katta qiziqish uyg'otdi. Birinchidan, biz ulardan, masalan, termofillar 5, 6, fermentlar 7, 8 va membranalar 9 qanday yuqori haroratlarda barqarorligini yoki termofillarning haddan tashqari nurlanish darajasiga qanday bardosh bera olishini bilib olishimiz mumkin10. Ikkinchidan, ular yonilg'i ishlab chiqarish13,14,15,16, kimyoviy sintez (dihidro, spirtlar, metan, aminokislotalar va boshqalar)17, biologik qazib olish18 va termostabil biokatalizatorlar7 ,11 kabi ko'plab muhim biotexnologik ilovalar uchun asos bo'lib xizmat qiladi. 13. Xususan, hozirda hammaga ma'lum bo'lgan polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PZR)19 birinchi kashf etilgan termofillardan biri bo'lgan termofil Thermus aquaticus bakteriyasidan ajratilgan fermentni (Taq polimeraza) o'z ichiga oladi.
Biroq, termofillarni o'rganish oson ish emas va uni hech qanday biologik laboratoriyada improvizatsiya qilib bo'lmaydi. Xususan, tirik termofillarni in vitro har qanday standart yorug'lik mikroskopi bilan, hatto bozorda mavjud bo'lgan isitish kameralarida ham kuzatish mumkin emas, odatda 40 ° C gacha past haroratlar uchun baholanadi. 1990-yillardan beri faqat bir nechta tadqiqot guruhlari o'zlarini yuqori haroratli mikroskopiya (HTM) tizimlarini joriy etishga bag'ishladilar. 1994 yilda Glux va boshqalar. Isitish/sovutish kamerasi anaeroblikni saqlab qolish uchun yopiq to'rtburchaklar kapillyarlarning haroratini nazorat qiluvchi Peltier xujayrasidan foydalanish asosida yaratilgan 20 . Qurilma 2 °C/s tezlikda 100 °C gacha qizdirilishi mumkin, bu esa mualliflarga Thermotoga maritima21 gipertermofil bakteriyasining harakatchanligini o‘rganish imkonini beradi. 1999 yilda Horn va boshqalar. Hujayra bo'linishini / ulanishini o'rganish uchun tijorat mikroskopiyasiga mos keladigan qizdirilgan kapillyarlardan foydalanishga asoslangan juda o'xshash qurilma ishlab chiqilgan. Uzoq vaqt nisbiy harakatsizlikdan so'ng, 2012 yilda samarali HTMlarni qidirish, xususan, Horn va boshqalar tomonidan ixtiro qilingan qurilmadan foydalangan Wirth guruhining bir qator maqolalari bilan bog'liq holda qayta tiklandi. Bundan 15 yil muqaddam ko‘p sonli arxeyalarning, jumladan gipertermofillarning harakatchanligi qizdirilgan kapillyarlar yordamida 100°S gacha bo‘lgan haroratda o‘rganilgan23,24. Ular, shuningdek, tezroq isitishga erishish uchun original mikroskopni o'zgartirdilar (belgilangan haroratga erishish uchun 35 daqiqa o'rniga bir necha daqiqa) va muhit bo'ylab 2 sm dan ortiq chiziqli harorat gradientiga erishdilar. Ushbu harorat gradientini shakllantirish moslamasi (TGFD) biologik jihatdan tegishli masofalarda harorat gradientlari ichida ko'plab termofillarning harakatchanligini o'rganish uchun ishlatilgan 24, 25 .
Yopiq kapillyarlarni isitish jonli termofillarni kuzatishning yagona usuli emas. 2012 yilda Kuwabara va boshqalar. Issiqlikka chidamli yopishtiruvchi (Super X2; Cemedine, Yaponiya) bilan muhrlangan uy qurilishi bir martalik Pyrex kameralari ishlatilgan. Namunalar 110 ° C gacha qizdirishga qodir, lekin dastlab bioimaging uchun mo'ljallanmagan, sotuvda sotiladigan shaffof isitish plitasiga (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Yaponiya) joylashtirildi. Mualliflar 65 ° C da anaerob termofil bakteriyalarning samarali bo'linishini kuzatdilar (Thermosipho globiformans, ikki baravar ko'payish vaqti 24 minut). 2020 yilda Pulshen va boshqalar. Tijorat metall idishlarini (AttofluorTM, Thermofisher) samarali isitish ikkita uy qurilishi isitish elementi: qopqoq va sahna (PCR mashinasidan ilhomlangan konfiguratsiya) yordamida namoyish etildi. Bu assotsiatsiya bir xil suyuqlik haroratiga olib keladi va qopqoqning pastki qismida bug'lanish va kondensatsiyani oldini oladi. O-ringdan foydalanish atrof-muhit bilan gaz almashinuvini oldini oladi. Sulfoskop deb nomlangan ushbu HTM 75°C27 haroratda Sulfolobus acidocaldarius tasvirini olish uchun ishlatilgan.
Bu barcha tizimlarning e'tirof etilgan cheklovi havo ob'ektlaridan foydalanishni cheklash edi, har qanday moyni botirish bunday yuqori harorat uchun va >1 mm qalinlikdagi shaffof namunalar orqali tasvirlash uchun mos emas edi. Bu barcha tizimlarning e'tirof etilgan cheklovi havo ob'ektlaridan foydalanishni cheklash edi, har qanday moyni botirish bunday yuqori harorat uchun va >1 mm qalinlikdagi shaffof namunalar orqali tasvirlash uchun mos emas edi. Obshchepriznannym nedostatkom vseh etix sistema bylo ogranichenie na ispolzovanie vozdushnyx ob'ektivov, poskolku lyuboe immersionnoe pogrujenie v maslo ne podxodilo uchun takoy vysokoy temperatury va vizualizatsii cherez prozrachnye mm1 obrazi >. Ushbu tizimlarning tan olingan kamchiliklari havo maqsadlaridan foydalanishni cheklash edi, chunki har qanday moyni botirish bunday yuqori harorat uchun mos emas va qalinligi > 1 mm bo'lgan shaffof namunalar orqali ko'rish uchun mos emas edi.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜, 任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1 毫米厚的透明样品成像. Bu barcha tizimlarning e'tirof etilgan cheklovi havo o'tkazgichli oynadan foydalanishning cheklanishidir, chunki har qanday yog'ga botirish bunday yuqori haroratlarda qalinligi > 1 mm bo'lgan shaffof namunalarni tasvirlash uchun yaroqsiz. Obshchepriznannym nedostatkom vseh etix sistema ogranichennoe ispolzovanie vozdushnyx ob'yektivov, lyuboe immersionnoe pogrujenie v maslo neprigodno uchun bunday yuqori harorat va vizualizatsii cherez prozrachnye obraztsyi mm1 to'lash. Ushbu tizimlarning tan olingan kamchiliklari havo linzalaridan cheklangan foydalanishdir, har qanday moyni botirish bunday yuqori haroratlar va 1 mm qalinlikdagi shaffof namunalar orqali vizualizatsiya uchun mos emas.Yaqinda bu cheklov Charlz-Orzag va boshqalar tomonidan olib tashlandi. 28, endi qiziqtirgan tizim atrofida issiqlikni ta'minlamaydigan, balki ITO (indiy-qalay oksidi) dan tayyorlangan rezistorning nozik shaffof qatlami bilan qoplangan qopqoq oynasining o'zida issiqlikni ta'minlaydigan qurilmani ishlab chiqdi. Qopqoqni shaffof qatlam orqali elektr tokini o'tkazish orqali 75 ° C gacha qizdirish mumkin. Shu bilan birga, muallif ob'ektivga zarar bermaslik uchun ob'ektivni ham qizdirishi kerak, lekin 65 ° C dan oshmasligi kerak.
Ushbu ishlar shuni ko'rsatadiki, samarali yuqori haroratli optik mikroskopiyani ishlab chiqish keng qo'llanilmagan, ko'pincha uy qurilishi uskunalarini talab qiladi va ko'pincha fazoviy o'lchamlari xarajatiga erishiladi, bu termofil mikroorganizmlar bir nechtadan katta emasligini hisobga olsak, bu jiddiy kamchilikdir. mikrometrlar. Isitish hajmining kamayishi HTM ning uchta o'ziga xos muammosini hal qilishning kalitidir: zaif fazoviy ruxsat, tizim qizib ketganda yuqori termal inersiya va haddan tashqari haroratlarda atrofdagi elementlarning (immersion moyi, ob'ektiv linzalari ... yoki foydalanuvchi qo'llari) zararli isishi. ).
Ushbu maqolada biz rezistorli isitishga asoslanmagan termofil kuzatuvi uchun HTM ni kiritamiz. Buning o'rniga biz yorug'likni yutuvchi substratni lazer nurlanishi orqali mikroskopning ko'rish maydonining cheklangan hududida lokal isitishga erishdik. Harorat taqsimoti miqdoriy fazali mikroskop (QPM) yordamida vizualizatsiya qilindi. Ushbu usulning samaradorligini Geobacillus stearothermophilus, harakatchan termofil bakteriya, taxminan 65 ° C haroratda ko'payadi va qisqa muddatli ikki baravar ko'payadi (taxminan 20 minut) va Sulfolobus shibatae, 80 ° C da optimal darajada o'sadigan gipertermofil (archaea) tasvirlash uchun. Oddiy replikatsiya tezligi va suzish haroratning funktsiyasi sifatida kuzatildi. Ushbu lazer HTM (LA-HTM) qoplamaning qalinligi yoki ob'ektivning tabiati (havo yoki moyga botirish) bilan cheklanmaydi. Bu bozordagi har qanday yuqori aniqlikdagi linzalardan foydalanish imkonini beradi. Bundan tashqari, termal inertiya tufayli sekin isitishdan aziyat chekmaydi (millisekundlik miqyosda lahzali isitishga erishadi) va faqat savdoda mavjud bo'lgan komponentlardan foydalanadi. Yagona yangi xavfsizlik tashvishlari qurilma ichida va ehtimol ko'zlar orqali kuchli lazer nurlari (odatda 100 mVt gacha) mavjudligi bilan bog'liq bo'lib, ular himoya ko'zoynaklarini talab qiladi.
LA-HTM printsipi mikroskopning ko'rish maydonida namunani lokal ravishda isitish uchun lazerdan foydalanishdir (1a-rasm). Buning uchun namuna yorug'likni yutuvchi bo'lishi kerak. O'rtacha lazer quvvatini (100 mVt dan kam) ishlatish uchun biz yorug'likning suyuq muhit tomonidan yutilishiga tayanmadik, lekin substratni oltin nanozarrachalar bilan qoplash orqali namunaning yutilishini sun'iy ravishda oshirdik (1c-rasm). Oltin nanozarrachalarini yorug'lik bilan isitish termal plazmonika sohasida muhim ahamiyatga ega bo'lib, biotibbiyot, nanokimyo yoki quyosh nurini yig'ishda kutilayotgan qo'llanmalar29,30,31. So'nggi bir necha yil ichida biz ushbu LA-HTM dan fizika, kimyo va biologiyadagi termal plazma ilovalari bilan bog'liq bir nechta tadqiqotlarda foydalandik. Ushbu usulning asosiy qiyinligi oxirgi harorat rejimini ko'rsatishdadir, chunki yuqori harorat namunadagi mikro miqyosli hudud bilan cheklangan. Ikki o'lchovli diffraktsiya panjaralaridan (shuningdek, o'zaro faoliyat panjaralar sifatida ham tanilgan) foydalanishga asoslangan oddiy, yuqori aniqlikdagi va miqdoriy fazali mikroskopiyaning juda sezgir usuli bo'lgan to'rt to'lqin uzunlikdagi ko'ndalang kesishma interferometri yordamida haroratni xaritalash mumkinligini ko'rsatdik. 33,34,35,36. Kesishgan panjarali to'lqinli mikroskopga (CGM) asoslangan ushbu termal mikroskopiya texnikasining ishonchliligi so'nggi o'n yil ichida nashr etilgan o'nlab maqolalarda ko'rsatildi37,38,39,40,41,42,43.
Parallel lazerli isitish, shakllantirish va harorat mikroskopini o'rnatish sxemasi. b Oltin nanozarrachalar bilan qoplangan qoplamani o'z ichiga olgan AttofluorTM kamerasidan iborat namuna geometriyasi. c Namunaga diqqat bilan qarang (miqyosda emas). d yagona lazer nurlari profilini va (e) oltin nanozarrachalarning namuna tekisligida simulyatsiya qilingan keyingi harorat taqsimotini ifodalaydi. f - (g) da ko'rsatilgan harorat taqsimotining simulyatsiyasida ko'rsatilganidek, bir xil haroratni yaratish uchun mos bo'lgan halqali lazer nurlari profilidir. O'lchov paneli: 30 mikron.
Xususan, yaqinda biz sutemizuvchilar hujayralarini LA-HTM va CGM bilan isitishga erishdik va 37-42 ° C oralig'ida uyali issiqlik zarbasi reaktsiyalarini kuzatdik, bu usulning yagona tirik hujayra tasviriga qo'llanilishini ko'rsatdi. Biroq, LA-HTM ni mikroorganizmlarni yuqori haroratlarda o'rganishda qo'llash bir ma'noli emas, chunki u sutemizuvchilar hujayralariga nisbatan ko'proq ehtiyotkorlikni talab qiladi: birinchidan, muhitning tubini o'nlab darajaga (bir necha darajaga emas) qizdirishga olib keladi. kuchli vertikal harorat gradientiga. suyuqlik konvektsiyasini 44 hosil qilishi mumkin, bu esa substratga mahkam bog'lanmagan bo'lsa, bakteriyalarning istalmagan harakati va aralashishiga olib kelishi mumkin. Ushbu konvektsiyani suyuqlik qatlamining qalinligini kamaytirish orqali yo'q qilish mumkin. Shu maqsadda quyida keltirilgan barcha tajribalarda bakterial suspenziyalar qalinligi taxminan 15 mkm bo'lgan metall idish ichiga joylashtirilgan ikkita qoplama orasiga joylashtirildi (AttofluorTM, Thermofisher, 1b,c-rasm). Suyuqlikning qalinligi isitish lazerining nurining o'lchamidan kichikroq bo'lsa, printsipial jihatdan konveksiyadan qochish mumkin. Ikkinchidan, bunday cheklangan geometriyada ishlash aerob organizmlarni bo'g'ib qo'yishi mumkin (S2-rasmga qarang). Bu muammoni kislorodni (yoki boshqa hayotiy gazni) o'tkazadigan substratdan foydalanish, qoplama ichida havo pufakchalarini qoldirish yoki yuqori qoplamada teshiklarni burg'ulash orqali oldini olish mumkin (S1-rasmga qarang) 45 . Ushbu tadqiqotda biz oxirgi yechimni tanladik (1b va S1-rasmlar). Nihoyat, lazerli isitish bir xil harorat taqsimotini ta'minlamaydi. Lazer nurlarining bir xil intensivligida ham (1d-rasm) harorat taqsimoti bir xil emas, balki termal diffuziya tufayli Gauss taqsimotiga o'xshaydi (1e-rasm). Maqsad biologik tizimlarni o'rganish uchun ko'rish sohasida aniq haroratlarni o'rnatish bo'lsa, notekis profillar ideal emas va agar ular substratga yopishmasa, bakteriyalarning termoforetik harakatiga ham olib kelishi mumkin (S3, S4-rasmga qarang)39. Shu maqsadda biz fazoviy yorug'lik modulyatoridan (SLM) foydalandik, ma'lum bir geometrik maydon ichida mukammal bir xil harorat taqsimotiga erishish uchun namuna tekisligidagi halqa shakliga (1f-rasm) ko'ra infraqizil lazer nurini shakllantirish, termal diffuziyaga qaramasdan (1d-rasm) 39, 42, 46. Muhitning bug'lanishiga yo'l qo'ymaslik uchun metall idishga (1b-rasm) yuqori qopqoqni qo'ying va kamida bir necha kun kuzating. Ushbu yuqori qoplama muhrlanmaganligi sababli, agar kerak bo'lsa, qo'shimcha vositani istalgan vaqtda osongina qo'shish mumkin.
LA-HTM qanday ishlashini ko'rsatish va uning termofil tadqiqotida qo'llanilishini ko'rsatish uchun biz 60-65 ° C atrofida optimal o'sish haroratiga ega bo'lgan Geobacillus stearothermophilus aerob bakteriyalarini o'rgandik. Bakteriya, shuningdek, flagella va suzish qobiliyatiga ega, bu normal hujayra faoliyatining yana bir ko'rsatkichini ta'minlaydi.
Namunalar (1b-rasm) bir soat davomida 60 ° C da oldindan inkubatsiya qilindi va keyin LA-HTM namuna ushlagichiga joylashtirildi. Bu oldindan inkubatsiya ixtiyoriy, ammo ikkita sababga ko'ra foydalidir: Birinchidan, lazer yoqilganda, hujayralar darhol o'sib, bo'linishiga olib keladi (Qo'shimcha materiallarda M1 filmiga qarang). Oldindan inkubatsiya qilinmasa, har safar namunadagi yangi ko'rish maydoni qizdirilganda bakterial o'sish odatda 40 daqiqaga kechiktiriladi. Ikkinchidan, 1 soatlik inkubatsiyadan oldingi inkubatsiya bakteriyalarning qopqoqqa yopishishini kuchaytirdi, lazer yoqilganda termoforez tufayli hujayralar ko'rish maydonidan chiqib ketishining oldini oldi (Qo'shimcha materiallarda M2 filmiga qarang). Termoforez - bu zarralar yoki molekulalarning harorat gradienti bo'ylab harakatlanishi, odatda issiqdan sovuqqa, va bakteriyalar bundan mustasno emas43,47. Ushbu kiruvchi ta'sir lazer nurini shakllantirish va tekis harorat taqsimotiga erishish uchun SLM yordamida ma'lum bir hududda yo'q qilinadi.
Shaklda. 2-rasmda oltin nanozarrachalar bilan qoplangan shisha substratni halqali lazer nuri bilan nurlantirish natijasida olingan CGM tomonidan o'lchangan harorat taqsimoti ko'rsatilgan (1f-rasm). Lazer nurlari bilan qoplangan butun maydonda bir tekis harorat taqsimoti kuzatildi. Bu zona 65 ° C, optimal o'sish haroratiga o'rnatildi. Bu hududdan tashqarida harorat egri chizig'i tabiiy ravishda \(1/r\) ga tushadi (bu erda \(r\) radial koordinata).
dumaloq maydonda tekis harorat rejimini olish uchun oltin nanozarrachalar qatlamini nurlantirish uchun halqali lazer nurlari yordamida olingan CGM o'lchovlarining harorat xaritasi. b Harorat xaritasining izotermasi (a). Lazer nurlarining konturi kulrang nuqtali doira bilan ifodalanadi. Tajriba ikki marta takrorlandi (Qo'shimcha materiallar, S4-rasmga qarang).
Bakteriya hujayralarining hayotiyligi LA-HTM yordamida bir necha soat davomida nazorat qilindi. Shaklda. 3 3 soat 20 daqiqalik filmdan olingan to'rtta tasvir uchun vaqt oralig'ini ko'rsatadi (M3 filmi, qo'shimcha ma'lumot). Bakteriyalar harorat 65 ° C ga yaqin bo'lgan lazer tomonidan aniqlangan dumaloq maydonda faol ravishda ko'payishi kuzatildi. Aksincha, harorat 10 soniya davomida 50 ° C dan pastga tushganda hujayra o'sishi sezilarli darajada kamaydi.
Turli vaqtlarda lazer bilan qizdirilgandan so'ng o'sadigan G. stearothermophilus bakteriyalarining optik chuqurlikdagi tasvirlari, (a) t = 0 min, (b) 1 soat 10 min, (c) 2 soat 20 min, (d) 3 soat 20 min. 200 Tegishli harorat xaritasiga qo'yilgan bir daqiqalik filmdan (Qo'shimcha ma'lumotda keltirilgan M3 film) olingan. Lazer \(t=0\) vaqtida yoqiladi. Intensivlik tasviriga izotermlar qo'shildi.
Hujayra o'sishi va uning haroratga bog'liqligini yanada aniqlash uchun biz Movie M3 ko'rish maydonida dastlab izolyatsiya qilingan bakteriyalarning turli koloniyalarining biomassasining o'sishini o'lchadik (4-rasm). Mini koloniya hosil qiluvchi birlik (mCFU) shakllanishining boshida tanlangan ota-ona bakteriyalari S6-rasmda ko'rsatilgan. Quruq massa o'lchovlari harorat taqsimotini xaritalash uchun ishlatilgan CGM 48 kamerasi bilan olingan. CGM ning quruq vazn va haroratni o'lchash qobiliyati LA-HTM ning kuchi hisoblanadi. Kutilganidek, yuqori harorat bakteriyalarning tezroq ko'payishiga olib keldi (4a-rasm). 4b-rasmdagi yarim log chizmasida ko'rsatilganidek, barcha haroratlarda o'sish eksponensial o'sishdan keyin sodir bo'ladi, bu erda ma'lumotlar eksponensial funktsiyadan foydalanadi \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), bu erda \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – hosil qilish vaqti (yoki ikki baravar koʻpayish vaqti), \( g =1/ \tau\) - o'sish tezligi (vaqt birligidagi bo'linishlar soni). Shaklda. 4c haroratning funktsiyasi sifatida tegishli o'sish tezligi va hosil qilish vaqtini ko'rsatadi. Tez o'sib borayotgan mCFU'lar ikki soatdan keyin o'sishning to'yinganligi, yuqori bakterial zichlik tufayli kutilgan xatti-harakat (klassik suyuqlik madaniyatidagi statsionar fazaga o'xshash) bilan tavsiflanadi. Umumiy shakli \(g\left(T\o'ng)\) (4c-rasm) G. stearothermophilus uchun 60-65 ° S atrofida optimal o'sish tezligi bilan kutilgan ikki fazali egri chiziqqa mos keladi. Ma'lumotlarni asosiy model yordamida moslang (S5-rasm)49, bu erda \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, bu adabiyotda keltirilgan boshqa qiymatlar bilan yaxshi mos keladi49. Haroratga bog'liq parametrlar takrorlanishi mumkin bo'lsa-da, \({G}_{0}\) ning maksimal o'sish tezligi bir tajribadan boshqasiga farq qilishi mumkin (S7-S9 rasmlari va M4 filmiga qarang). Universal bo'lishi kerak bo'lgan haroratni o'rnatish parametrlaridan farqli o'laroq, maksimal o'sish tezligi kuzatilgan mikroshkala geometriyasi doirasidagi muhitning xususiyatlariga (oziq moddalarning mavjudligi, kislorod kontsentratsiyasi) bog'liq.
Turli haroratlarda mikroblarning o'sishi. mCFU: Miniatyura koloniyalarini shakllantirish birliklari. Harorat gradientida o'sadigan bitta bakteriya videosidan olingan ma'lumotlar (M3 filmi). b (a) bilan bir xil, yarim logarifmik shkala. c Lineer regressiya (b) bo'yicha hisoblangan o'sish sur'ati \ (\ tau \) va hosil qilish vaqti \ (g \). Gorizontal xato chiziqlari: o'sish jarayonida mCFU ko'rish maydoniga kengaygan harorat oralig'i. Vertikal xato chiziqlari: chiziqli regressiya standart xatosi.
Oddiy o'sishdan tashqari, ba'zida ba'zi bakteriyalar lazerli isitish vaqtida ko'zga tashlanadi, bu flagellali bakteriyalar uchun kutilgan xatti-harakatlardir. Qo'shimcha ma'lumotlardagi M5 filmi bunday suzish faoliyatini ko'rsatadi. Ushbu tajribada 1d, e va S3-rasmlarda ko'rsatilganidek, harorat gradientini yaratish uchun bir xil lazer nurlanishidan foydalanildi. 5-rasmda M5 filmidan tanlangan ikkita tasvir ketma-ketligi ko'rsatilgan, unda bitta bakteriya yo'nalishli harakatni namoyon qiladi, qolgan barcha bakteriyalar esa harakatsiz qoladi.
Ikki vaqt oralig'i (a) va (b) nuqtali doiralar bilan belgilangan ikki xil bakteriyalarning suzishini ko'rsatadi. Rasmlar M5 filmidan olingan (qo'shimcha material sifatida taqdim etilgan).
G. stearothermophilus holatida bakteriyalarning faol harakati (5-rasm) lazer nuri yoqilgandan keyin bir necha soniyadan keyin boshlandi. Ushbu kuzatish, Mora va boshqalar tomonidan allaqachon kuzatilganidek, bu termofil mikroorganizmning haroratning oshishiga vaqtinchalik javobini ta'kidlaydi. 24 . LA-HTM yordamida bakterial harakatchanlik va hatto termotaksis mavzusini yanada chuqurroq o'rganish mumkin.
Mikrobial suzishni boshqa jismoniy harakat turlari bilan chalkashtirib yubormaslik kerak, ya'ni (i) aniq yo'nalishi bo'lmagan xaotik harakat kabi ko'rinadigan Broun harakati, (ii) harorat bo'ylab muntazam harakatlanishdan iborat bo'lgan konveksiya 50 va termoforez 43. gradient.
G. stearothermophilus mudofaa sifatida atrof-muhitning noqulay sharoitlariga ta'sir qilganda yuqori darajada chidamli sporalar (spora hosil bo'lishi) hosil qilish qobiliyati bilan mashhur. Atrof-muhit sharoitlari yana qulay bo'lganda, sporlar unib, tirik hujayralarni hosil qiladi va o'sishni tiklaydi. Ushbu sporulyatsiya / urug'lanish jarayoni yaxshi ma'lum bo'lsa-da, u hech qachon real vaqtda kuzatilmagan. LA-HTM dan foydalanib, biz bu erda G. stearothermophilusning unib chiqishi hodisalarining birinchi kuzatuvini xabar qilamiz.
Shaklda. 6a 13 sporadan iborat CGM to'plami yordamida olingan optik chuqurlikning (OT) vaqt oralig'idagi tasvirlarini ko'rsatadi. Butun yig'ish vaqti uchun (15 soat 6 min, \(t=0\) - lazerli isitishning boshlanishi), 13 sporaning 4 tasi unib chiqdi, ketma-ket vaqt nuqtalarida \(t=2\) soat, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' va \(11\) h \(30\)'. Ushbu hodisalardan faqat bittasi 6-rasmda ko'rsatilgan bo'lsa-da, qo'shimcha materialdagi M6 filmida 4 ta o'sish hodisasini kuzatish mumkin. Qizig'i shundaki, unib chiqishi tasodifiy ko'rinadi: atrof-muhit sharoitidagi bir xil o'zgarishlarga qaramay, barcha sporlar unib chiqmaydi va bir vaqtning o'zida unib chiqmaydi.
8 ta OT tasviridan (neftga botirish, 60x, 1,25 NA ob'ektiv) va (b) G. stearothermophilus agregatlarining biomassa evolyutsiyasidan iborat vaqt oralig'i. c (b) o'sish tezligining chiziqliligini ta'kidlash uchun yarim log shkala bo'yicha chizilgan (chiziq chiziq).
Shaklda. 6b, c ma'lumotlar yig'ishning butun davri davomida vaqt funktsiyasi sifatida ko'rish sohasidagi hujayra populyatsiyalarining biomassasini ko'rsatadi. Quruq massaning tez parchalanishi shaklda \(t=5\)h da kuzatilgan. 6b, c, ba'zi hujayralarning ko'rish maydonidan chiqishi tufayli. Ushbu to'rtta hodisaning o'sish tezligi \(0,77\pm 0,1\) h-1. Bu qiymat hujayralar normal o'sadigan 3. 3 va 4-rasm bilan bog'liq o'sish tezligidan yuqori. G. stearothermophilusning sporalardan o'sish sur'atining ortishi sababi aniq emas, ammo bu o'lchovlar LA-HTM ning qiziqishini ta'kidlaydi va hujayra hayotining dinamikasi haqida ko'proq ma'lumot olish uchun bitta hujayra darajasida (yoki bitta mCFU darajasida) ishlaydi. .
LA-HTM ning ko'p qirraliligini va uning yuqori haroratlarda ishlashini yanada ko'rsatish uchun biz optimal o'sish harorati 80 ° C51 bo'lgan gipertermofil atsidofil arxeya Sulfolobus shibatae o'sishini ko'rib chiqdik. G. stearothermophilus bilan solishtirganda, bu arxeyalar ham juda boshqacha morfologiyaga ega bo'lib, cho'zilgan tayoqchalar (batsillalar) emas, balki 1 mikronli sharlar (kokklar) ga o'xshaydi.
7a-rasm CGM yordamida olingan S. shibatae mCFU ning ketma-ket optik chuqurlikdagi tasvirlaridan iborat (Qo'shimcha materiallarda M7 badiiy filmiga qarang). Ushbu mCFU 73 ° C atrofida, optimal harorat 80 ° C ostida, lekin faol o'sish uchun harorat oralig'ida o'sadi. Biz bir necha soatdan keyin mCFUlarni arxeya mikrouzumlariga o'xshatgan ko'plab bo'linish hodisalarini kuzatdik. Ushbu OT tasvirlaridan mCFU biomassasi vaqt o'tishi bilan o'lchandi va 7b-rasmda taqdim etildi. Qizig'i shundaki, S. shibatae mCFUs G. stearothermophilus mCFUs bilan kuzatilgan eksponensial o'sishdan ko'ra chiziqli o'sishni ko'rsatdi. Hujayra o'sish sur'atlarining tabiati haqida uzoq vaqtdan beri muhokama qilingan 52: ba'zi tadqiqotlarda mikroblarning o'sish sur'atlari ularning hajmiga mutanosib bo'lgan (eksponensial o'sish) haqida xabar berilgan bo'lsa, boshqalari doimiy tezlikni (chiziqli yoki ikki chiziqli o'sish) ko'rsatadi. Tzur va boshq.53 tushuntirganidek, eksponensial va (bi) chiziqli o'sish o'rtasidagi farq biomassa o'lchovlarida <6% aniqlikni talab qiladi, bu ko'pchilik QPM texnikasi uchun, hatto interferometriyani ham o'z ichiga olgan holda amalga oshirilmaydi. Tzur va boshq.53 tushuntirganidek, eksponensial va (bi) chiziqli o'sish o'rtasidagi farq biomassa o'lchovlarida <6% aniqlikni talab qiladi, bu ko'pchilik QPM texnikasi uchun, hatto interferometriyani ham o'z ichiga olgan holda amalga oshirilmaydi. Kak ob'yasnili Tsur va dr.53, razlichenie eksponentsialnogo va (bi)lineynogo rosta trebuet tochnosti <6% bo'yicha biomassa, QPM uchun bo'lishish usullarini qo'llab-quvvatlamaydi, interferometriyadan foydalanish mumkin. Zur va boshq.53 tomonidan tushuntirilganidek, eksponensial va (bi) chiziqli o'sishni ajratish biomassa o'lchovlarida <6% aniqlikni talab qiladi, bu QPM usullarining ko'pchiligida, hatto interferometriyadan foydalanganda ham erishib bo'lmaydi.Zur va boshqalar tomonidan tushuntirilganidek. 53, eksponensial va (bi) chiziqli o'sishni farqlash biomassa o'lchovlarida 6% dan kam aniqlikni talab qiladi, bu ko'pchilik QPM usullari uchun, hatto interferometriyadan foydalanilganda ham erishib bo'lmaydi. CGM biomassa o'lchovlarida sub-pg aniqligi bilan bu aniqlikka erishadi36,48.
6 ta OT tasviridan (moyga botirish, 60x, NA maqsadi 1.25) va (b) CGM bilan o'lchangan mikro-CFU biomassasining evolyutsiyasidan iborat vaqt oralig'i. Qo'shimcha ma'lumot uchun M7 filmiga qarang.
S. shibatae ning mukammal chiziqli oʻsishi kutilmagan edi va hozircha xabar qilinmagan. Biroq, eksponensial o'sish kutilmoqda, hech bo'lmaganda vaqt o'tishi bilan 2, 4, 8, 16 ... hujayralarning bir nechta bo'linishi sodir bo'lishi kerak. Biz chiziqli o'sish hujayra zichligi juda yuqori bo'lganida hujayra o'sishi sekinlashishi va oxir-oqibat harakatsiz holatga kelishi kabi hujayraning zich qadoqlanishi tufayli hujayra inhibisyoniga bog'liq bo'lishi mumkin deb taxmin qildik.
Biz o'z navbatida quyidagi beshta qiziqishni muhokama qilish bilan yakunlaymiz: isitish hajmining qisqarishi, termal inertsiyaning kamayishi, oltin nanozarrachalariga qiziqish, miqdoriy faza mikroskopiyasiga qiziqish va LA-HTM ishlatilishi mumkin bo'lgan harorat oralig'i.
Rezistiv isitish bilan solishtirganda, HTMni ishlab chiqish uchun ishlatiladigan lazerli isitish bir nechta afzalliklarni beradi, biz ushbu tadqiqotda ularni ko'rsatamiz. Xususan, mikroskopning ko'rish sohasida suyuq muhitda isitish hajmi bir necha (10 mkm) 3 hajmda saqlanadi. Shu tarzda, faqat kuzatilgan mikroblar faol, boshqa bakteriyalar esa harakatsiz va namunani qo'shimcha o'rganish uchun ishlatilishi mumkin - har safar yangi haroratni tekshirish kerak bo'lganda namunani o'zgartirishga hojat yo'q. Bundan tashqari, mikro o'lchovli isitish haroratning katta diapazonini to'g'ridan-to'g'ri tekshirishga imkon beradi: 4c-rasm 3 soatlik filmdan (Movie M3) olingan, bu odatda bir nechta namunalarni tayyorlash va tekshirishni talab qiladi - o'rganilayotgan namunalarning har biri uchun bittadan. y - tajribadagi kunlar sonini ifodalovchi harorat. Isitilgan hajmni kamaytirish, shuningdek, mikroskopning barcha atrofdagi optik qismlarini, ayniqsa ob'ektiv linzalarni xona haroratida ushlab turadi, bu hozirgacha jamiyat duch kelgan asosiy muammodir. LA-HTM har qanday linzalar, shu jumladan moyli linzalar bilan ishlatilishi mumkin va hatto ko'rish sohasidagi haddan tashqari haroratlarda ham xona haroratida qoladi. Biz ushbu tadqiqotda xabar beradigan lazerli isitish usulining asosiy cheklovi shundaki, yopishmaydigan yoki suzmaydigan hujayralar ko'rish maydonidan uzoqda bo'lishi va o'rganish qiyin bo'lishi mumkin. Bir necha yuz mikrondan ortiq haroratni oshirish uchun past kattalashtiruvchi linzalardan foydalanish vaqtinchalik yechim bo'lishi mumkin. Bu ehtiyotkorlik fazoviy o'lchamlarining pasayishi bilan birga keladi, ammo agar maqsad mikroorganizmlarning harakatini o'rganish bo'lsa, yuqori fazoviy ruxsat talab qilinmaydi.
Tizimni isitish (va sovutish) uchun vaqt shkalasi \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) uning hajmiga bog'liq. qonunga muvofiq \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), bu erda \ (L\ ) - issiqlik manbasining xarakterli o'lchami (bizning tadqiqotimizdagi lazer nurining diametri \(L\ taxminan 100\) mkm), \(D\) - atrof-muhitning issiqlik tarqalishi (bizning o'rtacha korpus, shisha va suv Diffuziya tezligi\(D\ taxminan 2\qat {10}^{-7}\) m2/s). harorat o'zgarishini kutish mumkin, bu haroratning bir zumda o'rnatilishi nafaqat tajriba muddatini qisqartiradi, balki harorat ta'sirini har qanday dinamik o'rganish uchun aniq vaqtni \(t=0\) imkonini beradi.
Biz taklif qilgan usul har qanday yorug'lik yutuvchi substratga (masalan, ITO qoplamali tijorat namunalariga) tegishli. Biroq, oltin nanozarrachalari infraqizil nurda yuqori yutilishni va ko'rinadigan diapazonda past yutilishni ta'minlashga qodir, ularning oxirgi xarakteristikalari ko'rinadigan diapazonda, ayniqsa flüoresandan foydalanganda samarali optik kuzatish uchun qiziqish uyg'otadi. Bundan tashqari, oltin biologik mos, kimyoviy jihatdan inert, optik zichlik 530 nm dan yaqin infraqizilgacha sozlanishi va namuna tayyorlash oddiy va tejamkor29.
Transvers panjarali to'lqinli mikroskopiya (CGM) nafaqat haroratni mikro miqyosda xaritalash, balki biomassani kuzatish imkonini beradi, bu esa uni LA-HTM bilan birgalikda (agar kerak bo'lmasa) ayniqsa foydali qiladi. So'nggi o'n yil ichida, ayniqsa, bioimaging sohasida boshqa haroratli mikroskopiya usullari ishlab chiqildi va ularning aksariyati haroratga sezgir floresan zondlardan foydalanishni talab qiladi54,55. Biroq, bu usullar tanqid qilindi va ba'zi hisobotlar, ehtimol, flüoresansning haroratdan tashqari ko'plab omillarga bog'liqligi tufayli hujayralar ichidagi haroratning haqiqiy bo'lmagan o'zgarishlarini o'lchadi. Bundan tashqari, ko'pchilik lyuminestsent problar yuqori haroratlarda beqaror. Shuning uchun QPM va xususan, CGM optik mikroskop yordamida yuqori haroratlarda hayotni o'rganish uchun ideal haroratli mikroskopiya texnikasini ifodalaydi.
80°S da optimal yashovchi S. shibatae ni oʻrganish shuni koʻrsatadiki, LA-HTM oddiy termofillarni emas, balki gipertermofillarni oʻrganish uchun ham qoʻllanilishi mumkin. Aslida, LA-HTM yordamida erishish mumkin bo'lgan harorat oralig'ida hech qanday cheklov yo'q va hatto 100 ° C dan yuqori haroratlarga atmosfera bosimida qaynamasdan erishish mumkin, bu bizning 38 guruhimiz tomonidan atmosferada gidrotermal kimyo dasturlarida ko'rsatilgan. bosim A. Xuddi shu tarzda oltin nanozarrachalarini 40 isitish uchun lazer ishlatiladi. Shunday qilib, LA-HTM standart sharoitlarda (ya'ni, ekologik stress ostida) standart yuqori aniqlikdagi optik mikroskop bilan misli ko'rilmagan gipertermofillarni kuzatish uchun foydalanish imkoniyatiga ega.
Barcha tajribalar uy qurilishi mikroskop, jumladan Köhler yoritgichi (LED, M625L3, Thorlabs, 700 mVt), qo'lda xy harakati bilan namuna ushlagichi, maqsadlar (Olympus, 60x, 0,7 NA, havo, LUCPlanFLN60X yoki 60x, NA1il) yordamida amalga oshirildi. , UPLFLN60XOI), CGM kamera (QLSI o'zaro faoliyat panjarasi, 39 mkm pitch, 0,87 mm Andor Zyla kamera sensori) intensivlik va to'lqinli tasvirni ta'minlash uchun va sCMOS kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16 bitli rejim, Hamamatsu'dan) 5-rasmda ko'rsatilgan ma'lumotlar (bakterial suzish). Dikroik nurni ajratuvchi 749 nm BrightLine chekkasi (Semrock, FF749-SDi01). Kameraning old qismidagi filtr 694 qisqa o'tish filtri (FF02-694/SP-25, Semrock). Titan safir lazeri (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 Vt, nasosli tsunami lazeri bo'shlig'i, 2-5-rasmdagi Spektr-fizika, keyinchalik Millenia lazeri bilan almashtirilgan, Spectraphysics 10 Vt, pompalanadigan Mira lazer bo'shlig'i, Kogerent 2 uchun, -5). 6 va 7) toʻlqin uzunligi \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm ga oʻrnatiladi, bu oltin nanozarrachalarning plazmon rezonans spektriga mos keladi. Fazoviy yorugʻlik modulyatorlari (1920 × 1152 piksel) Meadowlark Optics kompaniyasidan sotib olindi.
O'zaro to'lqinli old mikroskopiya (CGM) an'anaviy kamera sensoridan bir millimetr masofada ikki o'lchovli diffraktsiya panjarasini (shuningdek, o'zaro faoliyat panjara deb ham ataladi) birlashtirishga asoslangan optik mikroskopiya usulidir. Ushbu tadqiqotda biz foydalangan CGM ning eng keng tarqalgan namunasi to'rt to'lqin uzunlikdagi ko'ndalang siljish interferometri (QLSI) deb ataladi, bu erda o'zaro faoliyat panjara Primot va boshqalar tomonidan kiritilgan va patentlangan intensivlik/fazali shaxmat taxtasi naqshidan iborat. 200034. Vertikal va gorizontal panjara chiziqlari datchikda to'rga o'xshash soyalarni hosil qiladi, ularning buzilish nurlanishining optik to'lqin frontining buzilishini (yoki ekvivalent faza profilini) olish uchun real vaqtda raqamli ishlov berish mumkin. Mikroskopda foydalanilganda, CGM kamerasi tasvirlangan ob'ektning optik yo'l farqini, shuningdek, optik chuqurlik (OT) sifatida ham tanilgan, nanometrlar darajasidagi sezgirlik bilan ko'rsatishi mumkin36. Har qanday CGM o'lchovida, optik komponentlar yoki nurlardagi har qanday nuqsonlarni bartaraf etish uchun asosiy mos yozuvlar OT tasvirini olish va keyingi tasvirlardan olib tashlash kerak.
Harorat mikroskopiyasi ma'lumotnomada ta'riflanganidek CGM kamerasi yordamida amalga oshirildi. 32. Xulosa qilib aytganda, suyuqlikni qizdirish uning sindirish ko'rsatkichini o'zgartiradi, bu esa tushayotgan nurni buzadigan termal linza effektini yaratadi. Ushbu to'lqin frontining buzilishi CGM tomonidan o'lchanadi va suyuq muhitda uch o'lchovli harorat taqsimotini olish uchun dekonvolyutsiya algoritmi yordamida qayta ishlanadi. Agar oltin nanozarrachalar namuna bo'ylab teng taqsimlangan bo'lsa, haroratni xaritalash bakteriyalardan xoli hududlarda yaxshiroq tasvirlarni yaratish uchun amalga oshirilishi mumkin, biz ba'zan shunday qilamiz. Malumot CGM tasviri qizdirilmasdan (lazer o'chirilgan holda) olingan va keyinchalik lazer yoqilgan holda tasvirning bir xil joyida olingan.
Quruq massani o'lchash haroratni ko'rish uchun ishlatiladigan bir xil CGM kamerasi yordamida amalga oshiriladi. CGM mos yozuvlar tasvirlari, bakteriyalar mavjudligi sababli OTdagi har qanday bir xillikni o'rtacha hisoblash vositasi sifatida ta'sir qilish vaqtida namunani x va y ga tez siljitish orqali olingan. Bakteriyalarning OT tasvirlaridan ularning biomassasi 2-bandda tasvirlangan protsedura bo'yicha Matlabning uy qurilishi segmentatsiyasi algoritmi ("Raqamli kod" bo'limiga qarang) yordamida tanlangan maydonlar bo'yicha tasvirlar ansambli yordamida olingan. 48. Qisqasi, biz \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} munosabatidan foydalanamiz. } x{{\mbox{d}}}y\), bu erda \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) optik chuqurlik tasviri, \(m\) quruq vazn va \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) doimiy hisoblanadi. Biz tirik hujayralar uchun odatiy konstanta bo'lgan \({{{\rm{\alpha))))))=0,18\) mkm3/pg ni tanladik.
Oltin nanozarrachalar bilan qoplangan 25 mm diametrli va 150 mkm qalinlikdagi qopqoq slipi oltin nanozarrachalari yuqoriga qaragan holda AttofluorTM kamerasiga (Thermofisher) joylashtirildi. Geobacillus stearothermophilus eksperimentlarning har bir kunidan oldin LB muhitida (200 rpm, 60 ° C) bir kechada oldindan kultura qilingan. Optik zichligi (OD) 0,3 dan 0,5 gacha bo'lgan G. stearothermophilus suspenziyasining 5 µl tomchisi oltin nanozarrachalar bilan qoplangan qopqoq ustiga qo'yildi. Shundan so'ng, diametri 18 mm bo'lgan, markazida diametri 5 mm bo'lgan teshikka ega dumaloq qopqoq slipi tomchi ustiga tushirildi va teshik markaziga bir xil optik zichlikdagi 5 mkl bakterial suspenziya qayta-qayta surtildi. Qopqoqlardagi quduqlar ref. 45 (qo'shimcha ma'lumot uchun Qo'shimcha ma'lumotga qarang). Keyin suyuqlik qatlami qurib qolmasligi uchun qoplamaga 1 ml LB muhiti qo'shing. Inkubatsiya paytida muhit bug'lanishining oldini olish uchun oxirgi qoplama Attofluor™ kamerasining yopiq qopqog'i ustiga qo'yiladi. Nihol bo'yicha tajribalar uchun biz an'anaviy tajribalardan so'ng, ba'zida yuqori qoplamani qoplaydigan sporalardan foydalandik. Shunga o'xshash usul Sulfolobus shibatae olish uchun ishlatilgan. Thiobacillus serrata 182 (DSMZ) muhitida uch kunlik (200 rpm, 75 ° C) dastlabki etishtirish amalga oshirildi.
Oltin nanozarrachalarining namunalari mitselyar blokli kopolimer litografiyasi yordamida tayyorlangan. Ushbu jarayon bobda batafsil tavsiflangan. 60. Qisqacha aytganda, oltin ionlarini o'rab turuvchi mitsellalar sopolimerni HAuCl4 bilan toluolda aralashtirish orqali sintez qilindi. Keyin tozalangan qoplamalar eritmaga botirildi va oltin urug'ini olish uchun qaytaruvchi vosita ishtirokida UV nurlanishi bilan ishlov berildi. Nihoyat, oltin urug'lari 16 daqiqa davomida KAuCl4 va etanolaminning suvli eritmasi bilan qoplangan qoplama bilan aloqa qilish orqali o'stirildi, buning natijasida yaqin infraqizilda sferik bo'lmagan oltin nanozarrachalarning kvazi-davriy va juda bir xil joylashishiga olib keldi.
Interferogrammalarni OT tasvirlariga aylantirish uchun biz havolada batafsil tavsiflanganidek, uy qurilishi algoritmidan foydalandik. 33 va Matlab paketi sifatida quyidagi umumiy omborda mavjud: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paket yozib olingan interferogrammalar (shu jumladan mos yozuvlar tasvirlari) va kamera massivlari masofalari asosida intensivlik va OT tasvirlarini hisoblashi mumkin.
Berilgan harorat rejimini olish uchun SLMga qo'llaniladigan faza naqshini hisoblash uchun biz avval ishlab chiqilgan uy qurilishi algoritmidan 39,42 foydalandik, u quyidagi umumiy omborda mavjud: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Kirish raqamli yoki monoxrom bmp tasviri orqali o'rnatilishi mumkin bo'lgan istalgan harorat maydonidir.
Hujayralarni segmentlarga bo'lish va ularning quruq vaznini o'lchash uchun biz quyidagi ommaviy omborda chop etilgan Matlab algoritmimizdan foydalandik: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Har bir rasmda foydalanuvchi qiziqtirgan bakteriya yoki mCFU ni bosishi, tayoqchaning sezgirligini sozlashi va tanlovni tasdiqlashi kerak.
Tadqiqot dizayni haqida ko'proq ma'lumot olish uchun ushbu maqolaga havola qilingan Tabiatni o'rganish hisobotiga qarang.
Ushbu tadqiqot natijalarini tasdiqlovchi ma'lumotlar tegishli mualliflardan oqilona so'rov bo'yicha mavjud.
Ushbu tadqiqotda foydalanilgan manba kodi "Usullar" bo'limida batafsil yoritilgan va disk raskadrovka versiyalarini https://github.com/baffou/ saytidan quyidagi omborlardan yuklab olish mumkin: SLM_temperatureShaping, CGMprocess va CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singx, H., Damle, D. & Sharma, AK Termofillar va ularning keng spektrli ilovalari haqida tushuncha. Mehta, R., Singhal, P., Singx, H., Damle, D. & Sharma, AK Termofillar va ularning keng spektrli ilovalari haqida tushuncha.Mehta, R., Singhal, P., Singx, H., Damle, D. va Sharma, AK Termofillarning umumiy ko'rinishi va ularning keng qo'llanilishi. Mehta, R., Singhal, P., Singx, H., Damle, D. va Sharma, AK Mehta, R., Singhal, P., Singx, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singx H., Damle D. va Sharma AK Termofillarni chuqur tushunish va keng ko'lamli ilovalar.3 Biotexnologiya 6, 81 (2016).
Yuborilgan vaqt: 26-sentabr-2022